[发明专利]检测外源基因插入位点的方法

摘要

检测外源基因插入位点的方法。目前对外源基因的检测方法主要有PCR法、Southern Blot印迹法和DNA斑点杂交法。PCR法容易出现假阳性和重复性差，Southern Blot法操作十分复杂，而且费用高昂，DNA斑点杂交法无法达到对外源基因的准确定位。本发明的方法包括如下步骤：（一）转MC4R基因细胞系的获得；（二）接头引物及特异性引物序列设计；（三）基因组的酶切与纯化；（四）纯化后的基因组DNA连接接头；（五）两轮PCR扩增检测；（六）克隆测序与序列比对。本发明公开了一种检测外源基因插入位点的方法。

主权项

一种检测外源基因插入位点的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：（一）转MC4R基因细胞系的获得；将猪的黑素皮质素受体4基因作为外源基因，猪的肾源PK15细胞系作为宿主细胞，利用脂质体转染的方法，将连入到pcDNA3.1（+）真核表达载体上的pcDNA（+）‑MC4R真核表达质粒转入到PK15细胞系中，瞬时转染后，进行单克隆细胞株的筛选，最后富集单克隆细胞，提取RNA后，将其反转录成cDNA；（二）接头引物及特异性引物序列设计；①设计并合成接头JTf和JTr，接头序列为：JTf：5'‑ GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT‑ 3'，JTr：5'‑PO4 –ACCAGCCC –NH2‑3'；②根据接头序列设计并合成接头引物AP1和AP2，引物序列为：AP1：5'‑GTAATACGACTCACTATAGGGC‑3'，AP2：5'‑ ACTATAGGGCACGCGTGGT ‑3'；③根据插入基因片段启动子区序列pcDNA3.1（+）P_CMV区，设计并合成特异性引物GSP1和GSP2，引物序列为：GSP1:5'‑TAATAGGGTGGTGACAATGGTTTCTG‑3，GSP2: 5'‑ GTCGGTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG ‑3；被检测的转基因样品，不是通过pcDNA3.1（+）表达载体实现基因转入的，GSP1和GSP2根据载体的启动子区序列设计；（三）基因组的酶切与纯化；随机选取1个阳性转MC4R基因细胞，采用苯酚‑氯仿方法提取基因组DNA，将基因组DNA浓度校正到100ng/μL，取100μL基因组DNA，加入限制性内切酶Dra I，在37 ℃的条件下进行过夜酶切；（四）纯化后的基因组DNA连接接头；将酶切后的基因组DNA进行纯化后取4μL，加入25μM接头JTf和JTr1.9μL，在16 ℃的条件下进行过夜连接；（五）两轮PCR扩增检测；将上一步所得的连接产物内加入72 μLTE进行稀释，并在70 ℃的条件下反应5min，以此作为PCR模板，以AP1和SP1为引物进行第1轮PCR扩增；对扩增出条带的产物，用去离子水50倍稀释作为第2轮PCR扩增模板，以AP2和SP2为引物做第2轮PCR扩增；（六）克隆测序与序列比对；将第2轮PCR扩增产物的目的条带回收并纯化，连入pMD18‑T载体，转化入大肠杆菌后，摇菌，测序，将测得的结果采用BLAST方法与已提交的猪基因组序列进行比对，经DraI处理过的DNA片段与pcDNA3.1（+）‑MC4R序列完全一致。