[发明专利]一种K88黏附素蛋白FaeG的可溶性表达重组菌及其发酵培养方法

摘要

本发明公开了一种产肠毒素大肠杆菌K88黏附素蛋白FaeG的可溶性表达重组菌，先构建表达产肠毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因的重组质粒pET28a–FaeG，然后将重组质粒pET28a–FaeG与分子伴侣GroEL/GroES载体质粒pGro7共转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得共表达黏附素FaeG基因和分子伴侣GroEL/GroES基因的重组菌，本发明还公开了该重组菌的高密度发酵培养方法。本发明所提供的重组菌具有较高的黏附素蛋白FaeG可溶性表达水平，包涵体表达量明显降低，能够获得较高纯度的免疫原，并且获得的蛋白与理论蛋白具有较高一致性。

主权项

1.一种产肠毒素大肠杆菌K88黏附素蛋白FaeG的可溶性表达重组菌的高密度发酵培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)接种：将种龄为5～15h的重组菌菌液接种于基础培养基中，所述菌液的体积占基础培养基体积的5～15％，并添加终浓度为0.5‑1.5g/L的L‑阿拉伯糖；2)发酵：发酵时空气流量为2‑4vvm，罐内温度为27～32℃，随着发酵液中溶氧量缓慢下降，通过将转速与溶氧偶联，控制溶氧值在25～35％，并用氨水控制发酵液的pH为6.8～7.2；3)蛋白诱导表达：当发酵菌液的OD₆₀₀值达到9～11时，将温度降为15～20℃，并添加终浓度为0.1～1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，进行蛋白诱导表达；4)补料：通过加入补料培养基补加葡萄糖，设定补料程序为：9‑12h补加0.6g/L葡萄糖，12‑15h补加1.1g/L葡萄糖，15‑21h补加1.4g/L葡萄糖，21‑48h补加1.1g/L葡萄糖；5)发酵终止：48h后，终止发酵，所述基础培养基含有以下成分：葡萄糖10g/L；酵母粉18g/L；蛋白胨9g/L；KH₂PO₄17mmol/L；K₂HPO₄ 72mmol/L；MgSO₄ 1.2g/L；(NH₄)₂SO₄ 5g/L；EDTA 8.4mg/L；CaCl₂1.5g/L；CuCl₂ 1.5g/L；CoCl₂ 2.5g/L；FeCl₃ 27g/L；ZnCl₂ 5.25g/L；H₃BO₃ 3g/L；Na₂MoO₄2.5g/L；MnCl₂ 1.5g/L；FeSO₄ 2.8g/L；硫胺素4.5g/L；所述补料培养基含有以下成分：葡萄糖100g/L；蛋白胨15g/L；酵母粉30g/L；MgSO₄10g/L；所述产肠毒素大肠杆菌K88黏附素蛋白FaeG的可溶性表达重组菌是按以下方法制备的：1)从猪源产肠毒素大肠杆菌K88菌株中克隆黏附素FaeG基因，并将其连接至表达载体pET‑28a，构建出表达产肠毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因的重组质粒pET28a–FaeG；2)将重组质粒pET28a–FaeG与分子伴侣GroEL/GroES载体质粒pGro7共转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得共表达黏附素FaeG基因和分子伴侣GroEL/GroES基因的重组菌。