[发明专利]耐氧驯化动物双歧杆菌乳亚种BZ11的高密度发酵方法

摘要

本发明公开了耐氧驯化动物双歧杆菌乳亚种BZ11的高密度发酵方法，该方法包括两个步骤：⑴动物双歧杆菌乳亚种BZ11的驯化；(2)高密度发酵。高密度发酵是采用含有胡萝卜汁和卷心菜汁的优化的培养基对耐氧驯化后的菌株BZ11在5L发酵罐进行培养，控制的工艺条件为：接种量为10%，发酵液pH恒为6.0，发酵方式为膜过滤—耦合分批补料、膜过滤耦合分批补料培养。本发明的发酵方法，在培养72h后活菌数可达到2.29×10¹⁰cfu/mL，达到人们将其进行食品或医药添加所需的活菌数要求。适用于培养动物双歧杆菌乳亚种BZ11，使之服务于富含高活性双歧杆菌菌体的食品或药品生产，满足人们生活需求。

主权项

1.耐氧驯化动物双歧杆菌乳亚种BZ11的高密度发酵方法，其特征在于包括以下两个步骤：(1)动物双歧杆菌乳亚种BZ11的驯化分离纯化的动物双歧杆菌乳亚种BZ11用PTYG培养基保存，通过逐渐增加培养基中氧分压对该菌株进行耐氧驯化；具体步骤如下：首先，在无菌条件下挑取纯化培养后的初始菌株单菌落接种到PTYG培养基在20％CO₂培养箱进行培养；然后，采用2％的接种量在20％CO₂培养箱进行传代培养，连续传代5次后转到生化培养箱培养；最后，在转速为150r/min的摇床上振荡培养；驯化完毕后，测定菌株在生化培养箱中培养32h过程中的生长状况；驯化结果的检测：比较驯化前后菌株在0～32h之內的OD600，活菌数以及pH，并进一步比较它们的形态特征和生理生化特征，以及降胆固醇能力，确保驯化后的菌株未发生任何变异；(2)高密度发酵首先制备胡萝卜汁、卷心菜汁:使用榨汁机分别按1∶2的料液比对胡萝卜和卷心菜进行榨汁，煮沸之后用8层纱布进行过滤，再重复煮沸过滤一次，取滤液即胡萝卜汁、卷心菜汁；接着制备盐溶液：取无水CaCl₂0.2g,K₂HPO₄ 1.0g,KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.48g,Na₂CO₃ 10g,NaCl 2g；将CaCl₂和MgSO₄·7H₂O混合放入300mL蒸榴水中直至溶解；加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解，加入200mL蒸馏水，混合后贮存于4℃，得到盐溶液；之后制备PTYG培养基：取胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖10g，吐温80 1mL，L一半胱氨酸盐酸盐0.05g，盐溶液40mL，胡萝卜汁143.3mL，卷心菜汁177.8mL，蒸榴水1000mL，调pH值至6.5，121℃灭菌15min后，得到PTYG培养基，备用；接着进行高密度发酵:采用含有胡萝卜汁和卷心菜汁的上述PTYG培养基对耐氧驯化后的菌株BZ11在5L发酵罐进行培养，控制工艺条件为：接种量为10％，发酵液pH恒为6.0，发酵方式为膜过滤藕合分批补料培养；所述膜过滤耦合分批补料培养试验的做法是：将发酵罐装液2.7L进行高温高压灭菌，待冷却后按10％的接种量接入300mL培养48h后的种子液，接种到5L发酵罐中进行液体培养，控制发酵罐的装液量为3L、培养温度为37℃、转速150r/min，在发酵全过程中使用1mol/L的NaOH溶液控制发酵液的pH恒为6.0；然后进行膜过滤耦合培养，具体流程为发酵培养16h后开始采用膜过滤装置从发酵罐中过滤发酵液，控制在16～24h之间过滤出发酵液2L，过滤时可通过调节阀门大小控制滤液的流速；在24～32h过程中开始进行补料，补入新鲜培养基体积为2L；继续按同样方法进行，32～40h滤出发酵液2L，40～48h补入新鲜培养基2L，48～56h滤出发酵液2L，56～64h补入新鲜培养基2L，64～72h滤出发酵液2L后终止发酵；每隔4h用10mL无菌的注射器取样1次，共18次，测定发酵液的OD600，活菌数。