[发明专利]一种食用菌dsRNA病毒的检测方法

摘要

本发明公开了一种食用菌dsRNA病毒的检测方法，利用dsRNA单克隆抗体J2通过斑点杂交检测食用菌dsRNA病毒，所述方法包括：食用菌检测样品的制备，样品点于杂交膜上，利用封闭液快速封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点，杂交膜分别与dsRNA单克隆抗体J2、羊抗鼠IgG孵育后显色，肉眼观察颜色变化确定食用菌带毒情况。本发明可同时检测多个样品，具有操作方便、快速便捷、无需特殊的仪器设备、阳性信号清晰、容易判断等优点。

主权项

1.一种食用菌dsRNA病毒的检测方法，其特征在于：所述检测方法具体包括以下步骤：（1）检测样品的制备：将待检测的食用菌样品匀浆得到匀浆液，所述匀浆液以12000‑14000 rpm的转速离心1‑2 min，取上清液待用；其中，匀浆的具体操作为：将食用菌样品放入研具中，加入TE缓冲液及石英砂，所述食用菌样品与TE缓冲液的质量体积比为0.5g：200 μL，快速研磨匀浆得到匀浆液；或者，将食用菌样品放于含3个直径4 mm钢珠的2 mL离心管中，加入TE缓冲液，食用菌样品与TE缓冲液的质量体积比为0.1g：50 μL，置于FastPrep核酸提取仪器中匀浆，匀浆速度4.5K，时间 15至30 s；（2）点膜：根据样品数量剪取适当大小的膜，所述膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜，用铅笔划线将膜分成不同的方格，用于区分不同样品的位置，取上述匀浆后离心的上清液3‑5μL点样于膜上，将膜放置于烘箱烘干或室温自然干燥；（3）膜的封闭：根据膜的大小，在容器中加入一定体积的QuickBlock™封闭液，将膜放置在封闭液中，使封闭液完全浸没膜，置于水平摇床上封闭10‑15min；（4） dsRNA单克隆抗体孵育：利用TBST缓冲液将dsRNA单克隆抗体J2稀释2000‑3000倍，取出封闭后的膜用滤纸吸尽封闭液，立即放入稀释后的dsRNA单克隆抗体J2中，室温轻摇孵育1‑1.5小时或者在4℃孵育过夜；（5）洗膜：孵育后，以PBST缓冲液为洗涤液，将膜放于洗涤液中缓慢摇动洗涤5‑15min，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5‑15min，共洗涤3‑4次；（6）二抗孵育：二抗选用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST缓冲液稀释碱性磷酸酶标记的二抗，将膜放入稀释后的二抗中，室温轻摇孵育1‑1.5小时；（7）洗膜：以PBST缓冲液为洗涤液，将膜放于洗涤液中缓慢摇动洗涤5‑15min，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5‑15min，共洗涤3‑4次；（8）显色：将膜放于适量BCIP/NBT显色缓冲液中，显色缓冲液盖过膜，室温显色10‑30min，观察膜的颜色变化，判断食用菌样品是否携带dsRNA病毒。