[发明专利]一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法。将培养至第3代的骨髓间充质干细胞接种到培养液上培养；吸出培养液，再加入复合培养液感染4小时；补充复合培养液继续感染24h；吸去复合培养液，换上含10%FBS培养液继续感染20小时，得到带GFP的报告基因的细胞液；将实现表达GFP的细胞移入培养液中培养，得到带有GFP‑BMSCs的种子细胞；将人工肌腱支架，浸泡在DMEM低糖培养液中培养24h时将GFP‑BMSCs细胞种植到支架上继续培养48h，再转移到肌腱细胞诱导液中培养1～2周，得到人工肌腱的移植物。本发明制备的可作为组织工程化人工肌腱移植物植入体内损伤肌腱的修复。

主权项

1.一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法,其特征是：（1）骨髓间充质干细胞准备: 将培养至第3代的骨髓间充质干细胞接种到6孔板中DMEM低糖培养液上，接种的细胞浓度为1×10⁶/mL，置于细胞培养箱培养，培养到细胞汇合率达50%至70%；（2）慢病毒LV‑GFP转染BMSCs: 将DMEM低糖培养液吸出，再加入复合培养液，在细胞培养箱中以37℃温度，5%CO₂浓度培养条件，感染4小时；4小时时补充复合培养液至原体积，继续感染24h；吸去复合培养液，换上新鲜的含10%FBS的DMEM低糖培养液继续培养20小时，经过消化，得到带GFP的报告基因的BMSCs液；（3）转染细胞筛选:将实现表达GFP的BMSCs移入到已添加5～8μg/ml puromycin的含10%FBS的DMEM低糖培养液中培养，每12h更换上述培养液一次，培养48h后筛选出稳定转染的细胞株， 得到GFP‑BMSCs的种子细胞；（4）将组织工程化人工肌腱支架，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培养液中，并置于细胞培养箱中培养24h，使组织工程化人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培养液；将GFP‑BMSCs细胞以1～2×10⁵/mL的细胞浓度种植到人工肌腱支架上；以37℃温度，5%CO₂浓度培养条件，经过细胞培养箱先培养48h，再转移到肌腱细胞诱导液中培养1～2周，得到含有GFP‑BMSCs‑BC的组织工程化人工肌腱的移植物。