[发明专利]一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及利用该方法制成的真菌检测试剂盒。本发明方法包括微量真菌细胞的获取、真菌细胞壁破壁提取真菌原生质、微量真菌原生质gDNA的提取和扩增、微量gDNA建库、基因组测序、生物信息学分析比对、判定所检测真菌的种类等步骤。本发明方法实现了对微量真菌的高效检测，可以直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样本的分离、检测、鉴别及遗传信息的深入研究。本发明真菌检测方法及试剂盒适用于工业生产、环境监测、空气检测、土壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测以及医学检测等领域。

主权项

1.一种非诊断目的的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括以下步骤：(1)微量真菌细胞的获取：将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激光显微切割系统找到目的细胞，用激光强度37‑43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光显微切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1‑100个的目的细胞；(2)真菌细胞壁破壁：化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；1)将0.8M D‑山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4℃条件下浸泡目的细胞2小时；2)配制复合预处理剂：将50mM Tris，5mM EDTA，5％β‑巯基乙醇混合均匀；3)配制混合酶处理剂：按下述配方中的任一种配制混合酶处理剂：A：蜗牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/mL；B：蜗牛酶6mg/mL，溶菌酶4mg/mL；C：蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶4mg/mL，溶菌酶4mg/mL；D：蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶3mg/mL，纤维素酶3mg/mL；E：蜗牛酶4mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶3mg/mL；F：溶壁酶5mg/mL，溶菌酶4mg/mL，纤维素酶3mg/mL；G：蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶2mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶4mg/mL；4)将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35℃处理细胞1小时；5)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂；6)向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体；7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，35‑45℃处理3‑12小时；8)上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体；9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4‑10μl细胞悬液；(3)微量真菌原生质gDNA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述步骤中获得的4‑10μl细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌gDNA；(4)微量gDNA建库：利用DNA建库试剂盒对上述真菌gDNA进行建库；(5)基因组测序：对上述建库的真菌gDNA进行全基因组测序；(6)生物信息学分析：利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与相关公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。