[发明专利]一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于人骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌Galβ1‑4GlcNAcβ1‑3Galβ1‑3GlcNAc‑类人源糖链的方法。该方法包括以下步骤：包括综合利用流感嗜血杆菌lsg基因簇脂多糖合成机制、空肠弯曲杆菌pgl基因簇N‑糖链合成机制、大肠杆菌体内O抗原糖链合成机制及原核生物转录调控机制等，构建了适用于大肠杆菌K‑12系列菌株表达的重组载体；并在大肠杆菌体内利用人源骨架蛋白Fn3表达展示出类人源糖链。本发明的有益效果是，可以简单、快速、高效制备具有类人源糖链的融合蛋白，为高效低成本大量制备类人源化寡糖及N‑糖基化糖链修饰的药物蛋白提供基础。

主权项

1.一种基于骨架蛋白Fn3制备流感嗜血杆菌类人源糖链的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1）、构建带有糖基化修饰位点和6个组氨酸标签的人骨架蛋白Fn3表达载体pIG6-Fn3-Gly：/n（1）根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计糖基化修饰位点，根据模建结果，将糖基化修饰位点设计在Fn3骨架蛋白的c端，选择优化的糖基化位点DQNAT氨基酸序列，即将编码Fn3基因序列的3′端通过编码4个甘氨酸和一个丝氨酸的柔链与编码天冬氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸的N-糖基化识别序列融合，并在基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签His-tag，便于分离纯化：采用人纤维连接蛋白III型结构域Fn3蛋白为模式基因，在基因的5´末端引入编码6个组氨酸残基的重组蛋白，命名为Fn3-Gly；/n（2）将设计合成的基因Fn3-Gly，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pIG6上，得到重组载体pIG6-Fn3-Gly；/n2）、利用流感嗜血杆菌lsg基因簇脂多糖合成机制，空肠弯曲杆菌来源的寡糖转移酶基因pglB寡糖转移酶和大肠杆菌rfe酶的O糖链合成起始机制，构建具体步骤如下：/n(1)将pglB构建至克隆载体p15ara2，在质周腔内将合成的寡糖链转运到骨架蛋白Fn3上，载体命名为p15ara2-pglB；/n (2)将流感嗜血杆菌lsgDEF寡糖合成酶簇基因构建至载体p15ara2-pglB上，实现寡糖的特异性链接，将lsgDEF寡糖合成酶簇基因序列利用SmaI，XhoI酶切位点克隆构建至载体p15ara2-pglB上，命名为p15ara2-pglB-lsg；/n(3) 利用IN-Fusion克隆技术将大肠杆菌糖链合成起始酶基因序列rfe和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶基因序列pglK构建至克隆载体p15ara2-pglB-lsg：大肠杆菌rfe合成酶介导二磷酸尿核苷-葡萄糖与十一碳二烯磷酸酯以磷酸二酯键连接，是合成大肠杆菌O-抗原糖链的起始酶；空肠弯曲杆菌pglK翻转酶负责将合成的寡糖链翻转到质周腔内，最终类人源糖链合成基因簇表达载体命名为p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe，上述所得的类人源糖链合成基因簇表达载体的结构组成如说明书附图图3所示；/n3）、将表达载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe共转化入大肠杆菌DH5a菌株中，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白为骨架蛋白Fn3展示有类人源糖链，自动诱导寡糖合成和融合蛋白表达，自动诱导培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素氨苄青霉素和氯霉素，Western Blot检测表达及糖基化情况，具体步骤如下：/n将构建好的载体pIG6-Fn3-Gly和p15ara2-pglB-lsg-pglK-rfe电击转化大肠杆菌菌株CLM37，然后将转化子接种到3毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，氨苄青霉素和氯霉素的浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素，过夜培养；次日，以1:100接种到10毫升含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基的培养管中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6-0.9，氨苄青霉素和氯霉素的浓度为每毫升LB培养基含150微克氨苄青霉素，102微克氯霉素；在25-35℃、200rpm条件下1:100添加至含有氨苄青霉素和氯霉素的自动诱导培养基200毫升进行诱导表达48-96小时，青霉素和氯霉素的浓度为每毫升自动诱导培养基含150微克氨苄青霉素、102微克氯霉素，在此过程，在大肠杆菌质周腔内表达重组蛋白，采用离心的方法收集菌体，进行下一步分析；/n其中，LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L, 酵母提取物5g/L, 氯化钠10g/L；/n自动诱导培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸铵66g/L，阿拉伯糖10mmol/L，还包括0.5 % 甘油，0.05% 葡萄糖，0.2%乳糖；/n4）、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有类人源糖链的融合蛋白：用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白即为Fn3-lsg，通过 Western Blot方法和质谱分析进一步鉴定重组蛋白的组成。/n