[发明专利]一种近岸海水中副溶血性弧菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种近岸海水中副溶血性弧菌的检测方法，包括环境样品DNA提取、扩增目的片段、构建标准质粒模板、建立Q‑PCR定量标准曲线、环境样品副溶血性弧菌数测定五个步骤。与当下基于选择性培养法检测相比，该方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，由原方法的10‑12天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3‑4个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养副溶血性弧菌的问题，提高了鉴别的准确度。

主权项

一种近岸海水中副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)环境样品DNA提取采用抽滤系统将海水样品截留在微孔滤膜上，并提取膜上DNA；(2)扩增目的片段查阅相关文献，获得针对副溶血性弧菌特有的不耐热溶血毒素基因设计的引物，目的片段大小约200bp，引物信息如下：上游引物：ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA下游引物：GATGAGCGGTTGATGTCCAA利用菌种(阳性对照)以及环境样品进行PCR实验，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将呈现的目的条带切胶回收，进行测序；(3)构建标准质粒模板DNA片段经纯化后与T载体恒温连接过夜；连接结束后，利用热击法将连接获得的标准质粒导入大肠杆菌感受态中；挑取阳性克隆，提取质粒并测序检验；测序正确的质粒用于标准质粒模板使用；(4)建立Q‑PCR定量标准曲线提取完成后计算质粒模板的准确拷贝数；根据预估的海水中副溶血弧菌浓度对其进梯度稀释并建立定量标准曲线；反应完成后以Ct值和log拷贝数建立标准曲线；(5)环境样品副溶血性弧菌数测定采用Q‑PCR技术测定副溶血性弧菌DNA浓度。