[发明专利]一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法，包括大肠杆菌DNA提取、扩增目的片段、构建标准质粒模板、建立Q‑PCR定量标准曲线、环境样品大肠杆菌数测定五个步骤。与当下基于选择性培养法检测相比，本发明方法有以下优点：首先，缩短了检测时间，由原方法的10‑12天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3‑4个小时。其次，克服了原方法无法测定不可培养大肠杆菌的问题，提高了鉴别的准确度。

主权项

一种近岸海水中大肠杆菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)大肠杆菌DNA提取采用抽滤系统将海水中细菌截留在微孔滤膜上，并提取膜上DNA；(2)扩增目的片段查阅相关文献，获得针对大肠杆菌特有的大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)基因设计的引物，目的片段大小约622bp，引物信息如下：上游引物：TACAGGTGACTGCGGGCTTATC下游引物：CTTACCGGGCAATACACTCACTA利用菌种(阳性对照)以及海水环境样品进行PCR扩增实验；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带中的DNA片段；(3)构建标准质粒模板DNA片段经纯化后与T载体恒温连接过夜；连接结束后，利用热击法将连接获得的标准质粒导入大肠杆菌感受态中；挑取阳性克隆，提取质粒并测序检验。测序正确的质粒用于标准质粒模板使用；(4)建立Q‑PCR定量标准曲线提取完成后测定质粒浓度，并计算质粒模板的准确拷贝数；根据估计的海水样品病原菌浓度，选择合适的质粒模板浓度，对质粒提取液进梯度稀释并建立定量标准曲线；(5)环境样品大肠杆菌数测定采用Q‑PCR技术测定大肠杆菌DNA浓度。