[发明专利]一种DNMT3A基因检测的方法

摘要

本发明是一种DNMT3A基因检测的方法，包括的步骤有：基因组DNA的提取、DNA产物的琼脂糖凝胶电泳检测、PCR反应扩增DNMT3A基因、PCR产物测序、结果判定。本发明所述的一种DNMT3A基因检测的方法，使用方便，检测准确率高，而且减轻了患者检测中所受的痛苦。

主权项

一种DNMT3A基因检测的方法，其特征在于，包括的步骤有：基因组DNA的提取、DNA产物的琼脂糖凝胶电泳检测、PCR反应扩增DNMT3A基因、PCR产物测序、结果判定；(一)基因组DNA的提取(1).试剂准备：1)在蛋白酶K粉中加入3.3ml纯净去离子水，震荡溶解，室温下，静置30分钟以上，待彻底溶解后分装，于4℃保存备用；2)将160ml无水乙醇加入洗涤液中混匀备用；3)检查细胞裂解液，如果里面有沉淀可37℃温育，使其彻底溶解，冷至室温后备用；(2).抽取患者外周血约2ml，EDTA抗凝，按以下步驟提取基因组DNA：1)取1.5ml离心管，并加250μl细胞裂解液到离心管中；2)加200μl抗凝全血到细胞裂解液中，用移液器来回吸注几次，以彻底溶解残留在吸头上的血液，且充分混合以确保完全释放基因组DNA；3)每管加30μl蛋白酶K，旋满振荡混匀15S，室温下5000rpm瞬时离心，再56℃孵育约3分钟，根据血细胞裂解情况可适当延长至5分钟，裂解完全应为褐色；4)在上述裂解完全的混合液中加入250ul无水乙醇，上下颠倒几次后放在旋祸振荡器上震荡15秒，室温下5000rpm瞬时离心；5)将过滤离心柱置于1.5ml收集管(试剂盒内提供)中，再将步骤4)中所得混合液转入过滤离心柱中，室温下8000rpm离心1分钟；6)丢弃含废液的收集管，将过滤离心柱置于一个新的1.5ml收集管中，并在离心柱中加入750ul洗涤液，室温下8000rpm离心1分钟；7)重复上一步；8)将洗脱液置恒温金属浴上预热到65℃以提高洗脱效率；9)丢弃含废液的1.5ml收集管，将过滤离心柱置于另一洁净的1.5ml离心管中，在离心柱中央加入200ul预热的洗脱液，室温静置2‑3分钟；8000rpm离心1分钟洗脱基因组DNA；10)将离心管盖好，‑20℃保存备用；(二)DNA产物的琼脂糖凝胶电泳检测(1).胶液的制备：称取0.5g琼脂糖于锥形瓶中，加入100rnL0.5xTAE电泳缓冲液，在微波炉中加热至煮沸使琼脂糖颗粒完全溶解至溶液透明，此时琼脂糖凝胶浓度为0.5％；(2).胶板的制备：1)用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；调节梳子与底板间的距离约1mm，和挡板平行安放；2)向冷却至45‑50摄氏度的琼脂糖凝胶液中放入漠化乙锭(ethidhimbromide,EB)，轻轻摇勾使其终浓度为0.5ng/mL；然后用溶化的凝胶将胶带内侧封严；3)将琼脂糖凝胶小心倒入制胶板中，使胶液缓慢展幵，直到整个制胶板表面形成均匀胶层，一般厚度5mm左右，注意不要有气泡；4)室温静置约一小时，待胶充分凝固后拔出梳子备用，注意不要损伤梳子底部的凝胶；5)将制胶板连同胶一起放入电泳槽，加IxTAE电泳缓冲液至浸没胶约1mm左右；(3).点样：将电泳样品与溴酚蓝按6:1比例混合均匀后，用微量移液器将样品依次点入加样孔中；注意要及时更换Tip头，避免损坏凝胶或将凝胶底部刺穿；(4).电泳：点样完成后，盖上电泳槽盖，接通电源，采用3V/cm的电压；当溴酚蓝指示剂电泳条带在凝胶的中下段时，停止电泳；(5).观察结果：用紫外凝胶成像仪观察电泳胶板，并记录结果，在23000bp处出现较亮条带的即为提取成功，可继续进行下一步PCR反应扩增产物片段大小为845bp，扩增完成后，取2ul产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；(6).PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：按照以上DNA产物琼脂糖检测的方法制备胶液，此时琼脂糖凝胶溶液浓度应为1％、制备胶板、点样和电泳；在紫外灯下观察结果显示：样本在约845bp处出现较亮的DNA扩增条带，用紫外凝胶成像仪拍照并保存结果；(三)PCR反应扩增DNMT3A基因(1)、目的基因的选择及引物合成：针对DNMT3A基因突变热点，第882位精氨酸残基密码子(R882)位点设计合成引物，上游引物：AGGAGTTGGTGGGTGTGAGT；下游引物：TGCTCCTATCTGATCAGGCT；加TE缓冲液稀释至50pmol/ul，‑20℃保存；进行PCR反应前需要将TE缓冲液进一步稀释至10pmol/ul；(2).PCR反应体系和反应条件：反应体系总体积为20μl，包括如下：反应条件如下，循环35次：(3).PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：扩增产物片段大小为845bp，扩增完成后，取2ul产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；按照以上DNA产物琼脂糖检测的方法制备胶液，此时琼脂糖凝胶溶液浓度应为1％，制备胶板、点样和电泳；在紫外灯下观察结果显示：几乎所有样本均在约845bp处出现较亮的DNA扩增条带，用紫外凝胶成像仪拍照并保存结果；(四)PCR产物测序PCR扩增完成后，将产物‑20℃冻存备用，用DNA凝胶回收试剂盒进行产物纯化，用ABI3730测序仪和BigDyeTerminators试剂盒进行DNA测序，以Sanger双脱氧链终止法进行；(五)结果判定将DNA测序结果用Chrosmas软件进行分析，并与DNA数据库进行同源比较，其基因序列号为：NG_029465.1，判断各患者中有无DNMT3A基因突变，如果发现，则初步判定为患有恶性血液病。