[发明专利]一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法有效
| 申请号： | 201610543258.5 | 申请日： | 2016-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN105950613B | 公开（公告）日： | 2020-06-09 |
| 发明（设计）人： | 康振;陈坚;堵国成;丁雯雯;金鹏 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 耿晓岳 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性‑退火‑切割‑连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在1.5h内一次可以实现2‑4个非磷酸化DNA片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效组装上，可引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 体外 快速 组装 磷酸化 dna 片段 方法 | ||
【主权项】：
一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，其特征在于，所述方法首先对需要组装的DNA片段进行PCR以获得具有重叠末端的亚片段，所得亚片段经包括变性、退火、切割、连接的热循环反应进行重组；所述热循环反应在缓冲液中进行；缓冲液的pH为7.2‑7.6，含有终浓度1.0‑1.5mM的NAD+、2.0‑10.0mM的Mg2+；所述的切割由具有5'‑3'外切酶活性的耐热DNA聚合酶Taq DNA聚合酶催化；所述的连接由具有单链无间隙缺口连接功能的耐热DNA连接酶催化；所述方法中不需要对DNA片段和PCR所用的引物进行磷酸化处理。
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