[发明专利]一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法

摘要

本发明公开了一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，涉及酶检测和生物催化剂的高通量筛选。包括菌株培养、细胞破胞、进一步统一多种酶的反应条件(有机溶剂、温度、缓冲液及激活因子)、构建多种有机溶剂体系酶活性高通量检测平台等。通过在粗酶液中加入不同浓度的氯化钠，稳定耐盐、嗜盐酶的结构，使其正确折叠，减少假阴性的结果；并通过加入聚乙烯亚胺，提高氧化还原酶的稳定性，提高筛选效率。运用所建立平台可对大量菌株同时进行多种氧化还原酶耐多种有机溶剂耐受性的检测，有利于最大限度地同时挖掘所考察菌株的应用潜力,获得工业生物催化应用所需的耐有机溶剂的氧化还原酶，并提高筛选效率，减少人力、物力及时间成本的投入。

主权项

1.一种高通量检测菌株耐有机溶剂氧化还原酶的方法，其特征在于：包括：/n1)菌株培养：将巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)以1～10％的接种量接种入216L培养基中培养；/n2)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心，洗涤，重悬，获得的细胞用超声破碎后离心，上清液即为粗酶液；/n3)在步骤2)所得粗酶液中加入氯化钠溶液使其终浓度为1～3M，和/或在步骤3)所得粗酶液中加入pH 8.0～11.0的分子量为2～500kDa的支链PEI溶液使其终浓度为1～10mg/mL；/n4)氧化还原酶对有机溶剂耐受性测定：在平行条件下，向步骤3)所得溶液中分别添加不同的有机溶剂并使各有机溶剂的终浓度至10～30％(v/v)，于20～50℃、150～250rpm平行地震荡0.5～1.5h，然后利用酶标仪平行地同时测定加入有不同有机溶剂的体系中氧化还原酶在震荡不同时间后的剩余酶活力，以同时测定不同有机溶剂对氧化还原酶活性和稳定性的影响，从而同时得到该氧化还原酶对不同有机溶剂的耐受性；所述氧化还原酶为NADH或NADPH依赖型氧化还原酶；所述有机溶剂为乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、环己烷、二甲基亚砜。/n