[发明专利]一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法

摘要

本发明公开一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，经制备12种霉菌毒素混合母液、准备标准工作溶液、制备样品溶液、进行液相色谱‑串联三重四级杆质谱分析，绘制标准曲线及计算结果而完成检测霉变烟叶中12种霉菌毒素的浓度。本发明能够准确地对霉变烟叶中12种霉菌毒素进行定性及定量，能够有效的去除复杂基质对检测信号的干扰，同时不影响12种霉菌毒素相应值。本发明方法稳定性好，准确可靠、灵敏度高，操作简单快捷、重复性好，非常适合复杂基质霉变烟叶中12种霉菌毒素的分析。

主权项

一种检测霉变烟叶中12种霉菌毒素浓度的方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）制备12种霉菌毒素混合母液：分别称取桔青霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、柄曲霉素、黄绿青霉素、T‑2毒素、黄曲霉毒素M1、伏马毒素B2、伏马毒素B1、黄曲霉毒素混标的标准品于10mL容量瓶中，各采用甲醇溶解并定容，然后各分别移取1 mL上述12种溶液于25 mL容量瓶中，采用甲醇定容，得到12种霉菌毒素混合母液；取1ml标准溶液于25mL容量瓶中，并采用甲醇定容，得到内标溶液；（2）准备标准工作溶液：分别移取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL和1.0 mL步骤（1）所得12种霉菌毒素混合母液于10 mL容量瓶中，加入内标溶液1.0mL，采用体积浓度为0.1%的甲酸水溶液进行定容，得到标准工作溶液系列；（3）制备样品溶液：称取1.0 g磨碎的待测霉变烟叶样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL提取溶剂A，涡旋1min，振荡提取60min，再以5000rpm的转速离心5min后，将上清液转移到另一个50mL离心管中，然后向残渣中加入20mL提取溶剂B，涡旋1min，继续振荡提取30min，然后在5000rpm的转速下离心5min，合并第一次上清液；再次在5000rpm的转速离心5 min，取980μL终提取液于样品瓶中，加入20μL内标溶液，充分混匀，经0.22μm过滤膜后得到样品溶液；所述提取溶剂A是乙腈：水的体积比为80：20的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%；提取溶剂B是乙腈：水的体积比为20：80的混合溶液，并加入甲酸至甲酸体积浓度为0.1%；（4）进行液相色谱‑串联三重四级杆质谱分析：采用液相色谱‑串联三重四级杆质谱分析仪，分析检测的液相色谱、质谱条件如下：色谱柱为Waters Acquity BEH C18，1.7μm，2.1mm×100mm，柱温：25℃；流动相A为体积浓度0.1%的甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1%的甲酸甲醇溶液；梯度洗脱，条件为0 ~ 0.5 min：70% A，0.5 ~ 10 min：70% A ~ 0% A，10.0 ~10.1 min：0% A~70% A，10.1 ~14 min：70% A；流速：0.2 mL/min，进样体积5 μL；离子源：采用电喷雾电离源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：4000 V；（5）绘制标准曲线及计算结果：分别吸取步骤（2）制备的标准工作溶液系列中的各不同浓度溶液进行LC‑MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，以12种霉菌毒素定量离子峰面积对其所对应的质量浓度进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线；再吸取步骤（3）制备的样品溶液进行LC‑MS/MS分析，在步骤（4）确定的仪器参数下，得到12种霉菌毒素定量离子峰面积，代入回归方程，计算得到样品溶液中12种霉菌毒素的浓度。