[发明专利]一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的方法

摘要

本发明公开了一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的方法，是以胡麻花药培养获得的胚性愈伤组织为农杆菌侵染的受体，用含有外源基因的根癌农杆菌侵染受体后共培养，将共培养后的受体经过转基因愈伤组织的诱导和筛选，获得单倍体的胡麻转基因愈伤组织，进一步培养可以得到胡麻单倍体转基因植株或基因型纯合的二倍体转基因植株。该方法不仅效率高，转化愈伤GUS表达率高达66.7%，每个愈伤GUS表达频率达5.33，而且转化受体背景一致，可以在当代获得单倍性的胡麻转基因愈伤组织、转基因植株和基因型纯合的二倍体转基因植株，在分子标记、功能蛋白的定位、启动子活性的检测、基因工程、细胞工程、代谢工程等相关领域有广泛的应用价值。

主权项

1.一种获得胡麻转基因单倍体愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）转化受体的建立：采集单核靠边期的胡麻花药，通过花药培养诱导胚性愈伤组织，作为农杆菌侵染的受体，花药培养诱导胚性愈伤组织的方法为：取胡麻花蕾，置于4～6℃低温预处理3～7天，首先进行消毒，然后剥开花蕾，剥离花药接种于含YI固液培养基的三角瓶中，30℃黑暗条件下培养1天后，移至25℃光照条件下，培养20～25天，诱导胚性愈伤组织作为农杆菌侵染的受体；上述YI固液培养基由 MS + 6‑BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4‑D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 %琼脂，pH=5.8的固体培养基30毫升与不含琼脂、其他成分和pH相同的液体培养基5ml组成；2）农杆菌工程菌液的制备及侵染：将含有外源基因的农杆菌C58c1单菌落接种于YEP液体培养基中，28℃、260 rpm 振荡培养18小时；然后以1:100 的比例用YEP液体培养基进行扩大培养；待菌液的浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.6 后，4℃、5000 rpm 离心5分钟收集菌体，将菌体重悬于1/2 MS液体培养基至OD₆₀₀＝0.5～0.6，将步骤1）得到的花药愈伤组织浸泡于上述制备的菌液中浸染15～30min；3）受体与农杆菌共培养：将步骤2）中经过农杆菌侵染后的受体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后平铺于共培养基上，25℃黑暗培养3～5天，以在培养基上看见农杆菌单个菌斑为止结束共培养；上述共培养基的组成为MS + 6‑BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4‑D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5%琼脂，pH=5.8；4）转基因愈伤组织的诱导培养：将步骤3）中共培养结束后的转化愈伤组织转接到选择诱导培养基， 25℃、光照强度100μEm^‑2s^‑1 16h与20℃、黑暗8h交替培养，每隔15d继代一次或转接至分化培养基；上述选择诱导培养基的组成为MS + 6‑BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4‑D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 % 琼脂+ 草铵膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青霉素 250～500 mg/L，pH=5.8；分化培养基组成为MS + 6‑BA 0.1～1.0 mg/L + 2 %蔗糖 + 0.5 % 琼脂+ 草铵膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青霉素 250～500 mg/L，pH=5.8。