[发明专利]一种基于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性的方法

摘要

本发明公开了一种基于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性的方法，该方法以单链DNA(dC₁₂)为模板及稳定剂，通过NaBH₄还原AgNO₃合成银纳米簇(AgNCs)；PKA催化水解ATP将γ磷酸根转移到多肽底物的丝氨基酸上，利用Zr⁴⁺将磷酸化的多肽和AgNCs的模板DNA结合，构建分子探针；AgNCs作为晶种能够促使银染反应，生成银纳米颗粒使溶液由浅黄色变为黑色，多肽包裹AgNCs后抑制了银染反应，溶液变色速度减慢；同样AgNCs在电极表面会产生电信号，银染反应大大增强了AgNCs的电信号，蛋白磷酸化抑制了银染的发生，电信号减弱；利用该分子探针可以通过比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性，具有操作简单、灵敏度高、且检测用时短的优点。

主权项

1.一种基于比色法测定蛋白激酶PKA活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)采用含胞嘧啶单链DNA作为模板和稳定剂，以AgNO₃为原料及以NaBH₄为还原剂通过还原法，生成由纳米银分散负载在含胞嘧啶单链DNA上构成的AgNCs；2)将含AgNCs的溶液与ZrOCl₂溶液进行混合反应，得到混合液；3)将Mg(NO₃)₂溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液进行混合反应，得到酶反应液；4)将所述酶反应液与所述混合液进行混合反应，即得分子探针溶液；5)所述分子探针溶液与银染液混合，避光反应，通过ImageJ2x软件测定反应产物的相应平均灰度值；6)采用一系列不同浓度的PKA溶液，重复3)、4)和5)步骤，得到一系列相应的平均灰度值，建立PKA浓度与平均灰度值关系的标准曲线；7)采用待测Hela细胞裂解液，重复3)、4)和5)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。