[发明专利]带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种带有标记基因的Tet‑on诱导过表达的重组载体及构建方法，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了成本低而高效的载体系统及其相应的转基因方法来建立转基因细胞系，并通过可控诱导目的外源基因过表达来观察该基因在多能干细胞向造血分化过程中可能发挥的效应和功能。本发明中的载体也能够很好的应用于其他细胞或模式动物的转基因操作，以简化遗传研究的方法。

主权项

1.一种带有标记基因的Tet‑on诱导过表达的重组载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：设计5’引物GFP‑5’‑XhoI和3’引物T2A‑3’‑SwaI，以PB513B‑1载体为模板，PCR扩增出GFP‑T2A CDS片段，XhoI和MluI双酶切后切胶回收；pTRIPZ的一个衍生载体pHBTetOE‑puro‑Gata1，也经过XhoI和MluI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以 T4 DNA 连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞 DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成pHBTetOE‑GFP‑T2A‑C载体；其中，引物序列为：5’引物 GFP‑5’‑XhoI：5’ TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3’； 3’引物 T2A‑3’‑SwaI ：5’ TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTC CA 3’；步骤二：设计5’引物Tet‑on‑5’‑PB‑LVX和3’引物Tet‑on‑3’‑PB以pHBTetOE‑GFP‑T2A‑C载体为模板， PCR扩增出2.7kb长的Tet‑on相关元件，3’用T4 PNK磷酸化，5’引入XbaI位点，XbaI酶切后切胶纯化；PB513B‑1经过SpeI和HpaI双酶切后切胶回收；插入片段和载体片段以T4 DNA连接酶连接；将连接后的产物转化感受态细胞DH5α；并进行酶切鉴定与基因序列的测定，构建成PB‑Tet‑on‑OE载体；其中引物序列为：5’引物Tet‑on‑5’‑PB‑LVX：5’ CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3’；3’引物Tet‑on‑3’‑PB：5’ ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3’。