[发明专利]一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法

摘要

一种东乡野生稻genic‑SSR分子标记开发方法，所述方法步骤为：东乡野生稻Unigene‑EST序列的获得；东乡野生稻SSR序列的识别；东乡野生稻genic‑SSR引物的设计；东乡野生稻genic‑SSR引物的有效性和通用性鉴定。本发明利用生物信息学方法从东乡野生稻Unigene‑EST序列中挖掘SSR位点，进行genic‑SSR分子标记的开发，克服了东乡野生稻genic‑SSR分子标记获取困难的问题；使用东乡野生稻和不同品种的现代栽培稻对开发的genic‑SSR引物进行PCR鉴定，结果真实可靠；本发明方法简单，操作简便，获得的分子标记数量巨大，为东乡野生稻的遗传学研究及分子育种等奠定基础。

主权项

一种东乡野生稻genic‑SSR分子标记开发方法，其特征在于，所述方法步骤为：1）东乡野生稻Unigene‑EST序列的获得：通过美国国立生物技术信息中心网络数据库下载东乡野生稻转录组高通量测序数据，进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得Unigene集，然后利用TIGR Gene Indices Clustering软件和CD‑HIT软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余Unigene‑EST序列；2）东乡野生稻SSR序列的识别：采用SSR检索软件MISA对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene‑EST序列进行SSR位点查找；检索的限定条件为：重复基序为1‑6个碱基，重复单元数依次大于12次、6次、5次、5次、4次和4次；3）东乡野生稻genic‑SSR引物的设计：根据上述步骤(2)识别的SSR位点，使用primer3.0软件批量设计genic‑SSR引物，引物设计参数设定为：引物长度18‑28 bp；熔解温度55‑65^oC，60^oC为最优温度；产物大小为80‑300 bp；4）东乡野生稻genic‑SSR引物的有效性和通用性鉴定：提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增；PCR扩增反应程序采用15 μL的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 μL 10×PCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 μM引物和1U TaqDNA聚合酶；所述PCR扩增反应程序：95^oC预变性5 min；然后进入35个循环95^oC变性30s，55‑63^oC退火30s，72^oC延伸30s；最后72^oC延伸10 min；所述PCR扩增反程序结束后，扩增产物加入2 μL loading buffer，以50 bp DNA Ladder为DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3‑4%；电泳结束后，采用紫外凝胶成像系统观察并拍照；依据每条引物扩增的目的片段长度，若有80‑300 bp扩增产物检测出，该引物即为有效引物。