[发明专利]一种基于纳米铂探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法

摘要

一种基于纳米铂探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法，通过重组表达技术制备β‑乳球蛋白IgE表位串联体蛋白，再分别以串联体蛋白及β‑乳球蛋白为抗原，按常规技术制备相应多克隆抗体，再经亲和纯化制备特异性抗体。以串联体多克隆抗体为捕获抗体，生物素化β‑乳球蛋白多克隆抗体标记的纳米铂探针为检测抗体建立夹心ELISA法，经酶标仪检测吸光值，通过建立标准曲线，实现对食品中过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的定量检测。本发明具有操作简单、灵敏度高、特异性好、线性范围宽等优点，为高灵敏、高通量分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。

主权项

1.一种基于纳米铂探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法，其特征是按以下步骤：（1）基于表位疫苗设计原理，以牛乳β‑乳球蛋白IgE线性表位AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152、T细胞表位AA77~97，及间隔序列KK与G为基础；通过DNAStar软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转角和无规则卷曲结构；通过以上生物信息学方法的表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T‑K‑K‑B1‑G‑B6‑G‑B5‑G‑B3‑G‑B7‑G‑B2‑G‑B4；再合成串联体基因，并通过原核表达制备出牛乳β‑乳球蛋白表位串联体重组蛋白；最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得串联体多克隆抗体；（2）把β‑乳球蛋白与CNBr‑Sepharose 4B柱材偶联，制备免疫亲和柱；按常规方法用免疫亲和柱纯化抗血清中的β‑乳球蛋白多克隆抗体；（3）在每个IgE表位两端添各加一个氨基酸，并合成这7个IgE表位肽及其阻断肽；采用间接竞争ELISA法分析串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力；将β‑乳球蛋白标准品用碳酸盐缓冲液稀释后，100 μL/孔加入板A，4 ℃包被过夜，PBST洗三次，每次3 min扣干；另取一块酶标板B，板A与板B中每孔加入250 μL 的3%明胶溶液37 ℃封阻；板B封阻1 h后清洗，每孔加入串联体多克隆抗体和浓度梯度的多肽各70 μL，且以PBS为对照，37 ℃孵育1 h；板A用PBST清洗3次，从板B中取100 μL抗体与多肽的反应液加入到板A中，37 ℃孵育1 h后清洗，每孔加入100 μL OPD显色液，37 ℃避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后立即用酶标仪测吸光值；根据吸光值计算不同浓度肽的抑制率，根据抑制率高低反映串联体多克隆抗体对不同表位肽和阻断肽识别能力的强弱；（4）以牛乳β‑乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β‑乳球蛋白多克隆抗体；（5）按步骤（3）对β‑乳球蛋白多克隆抗体进行纯化；再把纯化得到的β‑乳球蛋白特异性多克隆抗体与长链生物素按1:20的摩尔比混合，冰浴2 h，再用脱盐柱除去多余的生物素；（6）取1 mL粒径约为20 nm的纳米铂溶液10,000×g室温离心15 min，去除上清，加990 μL pH为6.5的PBS重悬纳米铂沉淀，再加入10 μL 浓度为1mg/mL的生物素化的β‑乳球蛋白多克隆抗体，使抗体与纳米铂质量比为1:100，于4 ℃偶联过夜；接着10,000×g室温离心15 min，去除含未标记抗体的上清，加入1 mL保存液重悬沉淀标记抗体的纳米铂探针，保存液含1% BSA，0.1 % Triton X‑100，5%蔗糖的PBS，pH 6.5；（7）以串联体多克隆抗体为捕获抗体，标记抗体的纳米铂探针为检测抗体，β‑乳球蛋白为检测抗原，采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度；酶标板中每孔加入100 μL碳酸盐稀释的捕获抗体，4 ℃包被过夜，PBST洗三次，每次3 min并扣干，每孔加入250 μL 2%的明胶溶液，37 ℃封阻0.5 h；清洗后，每孔加入100 μL已知浓度梯度的β‑乳球蛋白，37 ℃孵育2 h；清洗后，每孔加入100 μL纳米铂探针，37 ℃孵育1 h；清洗后，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37 ℃孵育0.5 h；清洗后，每孔加入100 μL TMB溶液，37 ℃避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β‑乳球蛋白标准曲线；（8）将所需检测的食品进行提蛋白，离心去脂肪/沉淀，制备检测样；根据上述方法包被捕获抗体、封闭及清洗后，每孔加入100 μL预处理的样品，孵育清洗后，再按步骤（7）依次加入检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、TMB溶液，经H2SO4终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β‑乳球蛋白及其致敏性残基的含量。