[发明专利]一种EPS形成相关基因检测实验方法

摘要

本发明公开了一种EPS形成相关基因检测实验方法，包括以下步骤：刚果红平板法定性生物膜形成菌株；活化；收菌；总RNA反转录；PCR扩增基因片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；Real‑time PCR检测SluxS和icaD基因表达；Western Blot检测SluxS和icaD基因表达。本发明的方法操作简便、结果准确，WB检测结果与RT‑PCR检测结果的趋势基本一致。

主权项

一种权利要求1所述EPS形成相关基因检测实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、刚果红平板法定性生物膜形成菌株从‑80℃冰箱中取出菌株，复苏于LB平板上，37℃，培养20h，然后挑取一个单菌落复壮于LB平板上，37℃，培养20h，再从中挑取一个单菌落接种于刚果红平板中，37℃，培养18h，然后置于室温下72h，观察菌落生长情况；步骤2金黄色葡萄球菌在玻璃材料上静置成膜2.1活化取‑80℃冻存菌株，LB平板划线，37℃倒置过夜培养，第二天挑单克隆37℃LB液体培养基摇床培养过夜；2.2扩大培养将过夜培养的金黄色葡萄球菌以1∶1000的比例加入新的100mL LB培养基中，37℃摇床培养，每隔30min测一次OD₆₀₀，待OD₆₀₀值达到1.0，用无菌的LB液体培养基将菌稀释到OD 0.6；2.3静置成膜取6孔板，每孔放一个无菌的盖玻片，每孔添加3mL菌液，37℃静置培养过夜；步骤3、总RNA提取3.1收菌用1.5mLRNA free的EP管，8000rpm 5min收菌，弃上清，1×TE洗菌体一次；3.2菌体裂解每管加0.5mL Trizol，匀悬菌体，每管再加入Triton X‑100，用移液枪吹匀，100℃25min，迅速转移至冰浴；3.3RNA抽提加等体积的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡，直至充分乳化，溶液呈乳白色状后再室温静置5min，12000r/min 4℃10min离心；此时裂解液分为三层，即：无色的上清液，中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取无色上清液转移至另一新的1.5mL RNA free的EP管中；3.4沉淀RNA每管加1/10体积3M醋酸钠pH 2和2倍体积预冷无水乙醇，‑20℃放置20min，12000r/min 4℃10min离心；3.5漂洗小心彻底弃去上清，加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管，至沉淀块漂浮后，12000rmp 4℃离心10min，小心弃去乙醇；用无水乙醇再洗一次；3.6干燥样品室温晾干2‑5min；3.7溶解RNA样品加入适量DEPC水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀后，放冰上溶解30min左右；3.8浓度检测取2μL总RNA溶液，加入198μL纯水，紫外分光光度计检测浓度及纯度；测得RNA浓度后，取1μg进行逆转录，多余RNA放于‑80℃冰箱备用步骤4总RNA反转录按照下列体系加入到无RNA酶的PCR管中70℃反应5min，冰上冷却2min，瞬时离心；再按照下列体系一次加入5×buffer  4μLRNAsin     0.5μLM‑MLV      1μL25℃10min，42℃50min，95℃5min；加入30μL DEPC水，取2μL做为模板步骤5、PCR扩增基因片段51引物设计根据NCBI中基因序列，设计基因引物片段：送上海生工合成；52取灭菌的PCR薄壁管，按如下顺序依次加入如下试剂：53PCR参数如下：步骤6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测6.1溶液配制6.1.1 10×TBE缓冲液108g Tris碱55g硼酸40mL 0.5mol/L EDTA，pH8.0加水至1L用时以无菌水稀释；6.1.2 30％丙烯酰胺凝胶溶液29g丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺1g加水至100mL，37℃溶解，置于棕色瓶中4℃保存；6.1.3 10％过硫酸铵APS1mgAPS加9mL水，4℃保存一周；现用现配；6.1.4银染色溶液的组成：固定液：10％乙醇氧化液：1％硝酸染色液：0.1％硝酸银显色液：2％碳酸钠：无水碳酸钠6g，硫代硫酸钠0.3mg，溶于300mL纯水中，用时加入37％甲醛0.4mL；终止液：4％醋酸6.2聚丙烯酰胺凝胶的制备、点样与电泳6.2.1电泳装置的准备：将聚丙烯酰胺垂直电泳槽中的凝胶玻璃板充分洗净；晾干后小心装入制胶固定架隔条玻璃片在内、短玻片在外固定于制胶支架上；6.2.2聚丙烯酰胺凝胶的制备8％PAGE：6.2.3灌胶、点样将胶混匀后快速加入玻璃板夹层中，插入梳子，注意不要产生气泡；待胶凝固后1h以上，拔掉梳子，用水冲洗加样孔，然后用吸水纸吸去水分；将凝胶固定在电泳槽里，短玻片靠近槽内固定架；点样，加DNA Marker；6.2.4电泳向胶槽中加入电泳缓冲液(0.5×TBE)，250V电泳至溴酚蓝加样缓冲液适当位置时停止电泳；6.2.5回收垂直电泳槽中的电泳缓冲液，卸下玻璃板；将其置于染色缸内，用拨胶铲小心地将短玻片撬起，平稳拿开并放回原处；有时凝胶扔附着在隔条玻璃板上，可用拨胶铲沿隔条小心切割使之分离；6.3聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色6.3.1漂洗：将染缸中的凝胶，用蒸馏水冲洗一次；6.3.2固定：加入10％乙醇固定10min，弃去固定液，水洗3min；6.3.3氧化：加入1％硝酸，氧化3min，弃去氧化液；用水漂洗2次，每次10s；6.3.4染色：加入0.1％AgNO3，放在脱色摇床上，15‑30min后，将硝酸银倒掉，用水冲洗15s；6.3.5显色：用2％NaCO3显色，待条带清晰后将溶液倒掉，然后加入4％乙酸溶液终止显色；乙酸可回收待用；6.3.6胶浸泡水中至拍照或扫描；步骤7、Real‑time PCR检测SluxS和icaD基因表达采用2步法，以16sDNA为内参7.1体系：7.2程序：溶解曲线步骤：引物的设计采用Primer5，目的基因引物及产物大小如下：统计学分析采用的是相对定量，采用RQ＝2^‑ΔΔCT进行计算相对表达量；数据分析用的是EXCLE，作图用的是Graphpad prism 5软件；取表达量最高的两对引物，做普通PCR，扩增产物送上海生工测序；步骤8、Western Blot检测SluxS和icaD基因表达总蛋白提取8.1将40mL菌液在12000g，4℃下离心15min收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1mL裂解液悬浮菌体；8.2超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色；8.3 1000g离心去掉大碎片；8.4测定蛋白质浓度：采用碧云天BAC蛋白浓度测定试剂盒；8.5样品中加入loading buffer，100℃5min，分装放于‑80℃保存；SDS‑PAGE：8.7上样：12％电泳胶，将蛋白样品与SDS蛋白上样缓冲液混合后于100℃处理5min，每条泳道上样100μg细胞总蛋白；8.8电泳：电泳时浓缩胶电压为70V；当溴酚蓝品进入分离胶时，电压为110V；根据预染Marker和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断最佳跑胶时间；转膜：8.9将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min；8.10将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块转膜液湿润的海绵垫，再添加2层转膜液湿润的滤纸，将SDS‑PAGE胶小心地铺在滤纸上，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，将红色的正极板合上，夹好，插入转膜槽相应的位置；8.11转膜过程在冰水混合浴中进行，采用100V，时间根据蛋白分子量而定；8.12TBST洗膜，5min×3次；8.13封闭：一般抗体采用5％脱脂奶粉+TBST封闭；封闭时间为室温下一个小时，在摇床上进行；8.14一抗孵育：在一个1.5ml的EP管中加入1mL的封闭液5％脱脂奶粉+TBST，再加入适量的一抗Bcl2L2为1∶100；MCL1为1∶100；actin为1∶2000，置于4℃冰箱中过夜；8.15洗膜：将过夜杂交的膜从塑料袋中取出，投入含有足量体积TBST的洗膜盒中，于摇床上清洗，每次10min，连续3次；8.16二抗孵育：处理步骤类似一抗杂交步骤，不同之处在于二抗杂交可在常温下，1h内完成；二抗比例控制在羊抗鼠1∶4000；羊抗兔1∶2000；8.17洗膜：和步骤8.15相同；显影：将膜平放于干燥的平面上，将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到有铅笔记号标注的膜面上，反应5分钟后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，将膜平放到压片暗合中，在其上面放一张剪角标记的胶片，进行压片，5min后，取出在显影液里显影15s，水洗净后，进行定影。