[发明专利]土壤蔗糖酶的测定方法

摘要

土壤蔗糖酶的测定方法，它及蔗糖酶活性的测定方法。本发明的目的要解决现有比色法测定蔗糖酶活性准确性较低的问题。方法：一、配制显色剂3,5‑二硝基水杨酸溶液；二、配制质量分数为8％的蔗糖溶液；三、配制缓冲液；四、土样培养，得到培养后土样；五、测定步骤四的培养后土样过滤滤液在分光光度计上于波长508nm处比色；六、标准葡萄糖溶液配制；七、在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；八、空白对照检测；九、确定葡萄糖浓度；十、根据Suc＝a×V×n/m计算结果。优点：平行性好，变异系数小，方法可行性高。本发明主要用于测定土壤蔗糖酶。

主权项

1.土壤蔗糖酶的测定方法，其特征在于它是按以下步骤进行：一、配制显色剂3,5‑二硝基水杨酸溶液：首先向20mL～21mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL～51mL去离子水，并混匀，然后加入0.49g～0.51g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g～30.10g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5‑二硝基水杨酸溶液；二、配制蔗糖溶液：将8.00g蔗糖溶入去离子水中，定容至100mL，得到质量分数为8％的蔗糖溶液；三、配制缓冲液：将12.10g～12.14g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60g～11.64g顺丁烯二酸、14.00g～14.10g柠檬酸一水化合物和6.30g～6.34g硼酸依次溶于500mL～510mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸馏水定容至1000mL，得到缓冲液的储备液；取200mL～210mL缓冲液的储备液转移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L～0.14mol/L HCl将200mL～210mL缓冲液的储备液的pH调节至6.0，再用去离子水定容至1000mL，得到缓冲液；四、土样培养：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入15mL步骤二得到的质量分数为8％的蔗糖溶液，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到培养后土样；五、测定：将步骤四的培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5‑二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；六、标准葡萄糖溶液配制；将葡萄糖先在温度为50～58℃条件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，即得到标准葡萄糖溶液，再将标准葡萄糖溶液稀释10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的浓度为0.5mg/mL；七、标准曲线的绘制：依次称取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步骤六得到的葡萄糖工作液，分别注入6只50mL容量瓶中，用蒸馏水依次补齐至10mL，然后分别加3mL 3,5‑二硝基水杨酸，并在沸腾水浴锅中加热5min，随即将6只50mL容量瓶移至自来水流下冷却3min，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；八、空白对照检测：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到空白对照培养后土样；将空白对照培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5‑二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；九、确定葡萄糖浓度：根据步骤七得到的标准曲线依次确定步骤五中葡萄糖浓度a1和步骤八中葡萄糖浓度a2，a1‑a2＝a，a为步骤五中剩余葡萄糖浓度；十、结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g过完筛的待测土壤中葡萄糖的质量表示蔗糖酶活性Suc：Suc＝a×V×n/m式中：a为步骤五中剩余葡萄糖浓度，单位mg/mL；V为显色液体积；n为分取倍数；m为烘干土重，单位g。