[发明专利]一种外添加谷氨酸提高精氨酸产量的方法

摘要

本发明公开了一种外添加谷氨酸提高精氨酸产量的方法，钝齿棒杆菌的NCgl1221基因被敲除且同时增加了一个带启动子的lysE基因，使得谷氨酸只能进不能出且更多的精氨酸可以输送至细胞外，同时在发酵培养基中外添加谷氨酸，使得合成精氨酸有更多的前体物质，从而大幅度提高精氨酸的产量。

主权项

一种外添加谷氨酸提高精氨酸产量的方法，其特征在于，(1)谷氨酸运输蛋白编码基因NCgl1221同源臂的构建及其敲除质粒的构建：敲除钝齿棒杆菌NCgl1221基因的上下同源臂引物并分别在上下臂引物的5‘端加上HindIII和XbaI限制性内切酶位点，分别通过PCR技术扩增NCgl1221的上下同源臂，采用DNA纯化试剂盒纯化其上下同源臂，等摩尔混合后进行重叠PCR获得NCgl1221基因敲除同源臂；通过HindIII和XbaI双酶切，将NCgl1221基因敲除同源臂克隆至蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，获得敲除质粒pK18mobsacB‑ΔNCgl1221，将其电转至钝齿棒杆菌并通过二次同源重组获得钝齿棒杆菌ΔNCgl1221缺失株；(2)在敲除NCgl1221的位置，插入lysE基因过表达精氨酸运输蛋白：设计引物，通过PCR扩增NCgl1221缺失的上下同源臂，扩增lysE基因的上游引物的5‘端修饰Ptac启动子及核糖体结合位点，通过PCR获得带强启动子的lysE基因，通过重叠PCR将lysE基因与NCgl1221缺失的上下同源臂连接后，克隆至蔗糖致死质粒pK18mobsacB中，将重组质粒电转至钝齿棒杆菌并通过二次同源重组获得钝齿棒杆菌ΔNCgl1221：：lysE^tac；(3)摇瓶发酵：在28～30℃种子培养基中活化钝齿棒杆菌及钝齿棒杆菌ΔNCgl1221::lysE^tac，培养14～16h后以5％～10％v/v的接种量接种至发酵培养基中，在28～30℃发酵生长至对数生长初期加入5％谷氨酸诱导高产精氨酸。