[发明专利]一种高效联产L-苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略

摘要

本发明是一种将葡萄糖脱氢酶与L‑亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中单独和共表达，利用重组大肠杆菌酶法和全细胞法联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸盐的方法。本发明在于：将葡萄糖脱氢酶基因和L‑亮氨酸脱氢酶基因构建重组单独和共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。利用重组菌酶法和全细胞法转化可以促进辅因子在转化体系中的循环，仅需添加少量外源辅因子或不添加外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用底物苯甲酰甲酸及葡萄糖联产高附加值的L‑苯苷氨酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中转化2‑4h，该方法所得的L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸产量分别可达58.8g/L及75.6g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

主权项

一种通过重组大肠杆菌表达葡萄糖脱氢酶和L‑亮氨酸脱氢酶用于联产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下内容：(1)将L‑亮氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌；(2)酶法转化生产L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸：首先将L‑亮氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶分别在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，将培养好的重组大肠杆菌细胞分别在pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤，然后将细胞分别在冰浴超声破碎，在pH6.0‑8.0的100mM PB缓冲液中，在加入GDH和LeuDH酶活分别为10U/ml和6U/ml的粗酶液，0.1mM NAD⁺的情况下，加入700m M苯甲酰甲酸、900mM葡萄糖及0.5M的NH₄Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸；(3)全细胞转化法：首先将L‑亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共同在大肠杆菌中过量表达获得重组大肠杆菌，利用pH8.0的100mM PB缓冲液洗涤细胞然后以PB缓冲液等体积悬浮，在加入5％的甘油和4％的曲拉通的情况下，投入500m M苯甲酰甲酸、750mM葡萄糖及0.5M的NH₄Cl，利用添加50％的氨水使转化的pH保持在8.0左右，并控制转化的温度在30℃，制备得到L‑苯甘氨酸和葡萄糖酸。