[发明专利]基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法

摘要

本发明公开了一种基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法：将获得的菌株依据其生理习性进行纯培养，依次获得对数期的菌株；并通过形态学、分类学、方法学对其进行鉴定；然后对确认的菌株进行预处理，干燥后采用乙醇/甲酸法和80%TFA提取法提取肽指纹图谱；并采用MALDI‑TOF MS质谱平台进行图谱的采集、处理，然后对菌株图谱进行参数确定，并将确定的标准谱图与菌株名称进行统一，标注该菌株的建库方法，完成该菌株的建库；其他菌株建库方法依次类推，完成微生物肽质量指纹图谱库的构建。本发明提供了从菌株的调查到数据库构建的一套完整方法，该数据库微生物种类齐全，将满足于微生物相关行业的鉴定需求。

主权项

一种基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法，其特征在于包括下述步骤：第一步，菌株的标准化首先将获得的菌株分别依据各自的生理习性在特定的培养基和培养条件下进行纯培养，依次获得对数期的菌株；并将培养得到的菌株采用保护剂进行保藏，使其长期稳定的存活；通过形态学对保藏存活的菌株进行验证，保证菌株的纯度为100%；通过分类学对保藏存活的菌株进行验证，保证菌株的名称正确无误；通过不同方法对同一菌株进行分子学鉴定，保证其鉴定结果的一致性；第二步，建库菌株肽指纹图谱的提取将第一步确认符合建库条件的细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体菌株进行预处理，对菌体进行灭活及脂质溶解，干燥后采用乙醇/甲酸法提取肽指纹图谱；将带有芽孢的菌株、依靠呼吸道传播的菌株以及生物安全性在二类以上的菌株采用80%TFA提取法提取肽指纹图谱；第三步，建库菌株肽指纹图谱的采集1）采集设备的确定 采用MALDI‑TOF MS质谱平台进行图谱的采集，仪器调整参数如下：（a）离子化激光源若采用氮气激发，波长为337nm；若采用固态激光，波长为355nm；（b）微生物标准谱图的肽质量指纹图谱的采集范围是2000‑20000Da之间；（c）激光激发的电荷为带一个正电荷的多肽或蛋白，采用线性正离子操作模式，离子源1电压 20 KV，离子源2电压 17‑20KV，电子透镜电压 5‑10KV，延时提取时间为30‑400ns之间；（d）激光频率为40‑100HZ；（e）检测器电压在‑2kv到‑5kv之间，调试时以基质HCCA为背景峰，测定出检测器对其达到响应时的最低电压值；（f）仪器校准：采集谱图的激光击打次数设定为40‑200次；每次数据采集前采用大肠杆菌DH5a与肌红蛋白、核糖核酸RNA酶的混合的蛋白进行仪器校准，选取八个均匀分布于2000‑20000Da的特征蛋白对仪器进行校准，其中校准的最大误差小于150ppm，校准方程为：y=ax²+bx+c,其中y代表m/z, x代表时间；2）采集 每个菌株的每个靶点采集3~5张图谱，每张图谱由4次以上累加获得，每次参与累加的图谱要符合以下条件：信噪比高于3.0、基线低且平、主体峰强度在2000‑20000之间，每个菌株符合要求的谱图在20~40张；3）图谱处理 将采集到的多张图谱在分析软件内进行分析，首先对每张图谱的特征峰进行比对，删除统计学意义上的明显区别于其他图谱的图谱，并删除不合格的图谱，合格图谱留存，图谱张数大于20，不满足需重新提取采集，以达到建库要求；第四步，建库1）对第三步采集的菌株图谱进行参数确定标准图谱参数设置如下：a）单个图谱特征峰的最大误差1500‑2400ppm;（b）创建标准肽质量指纹参考谱的误差在200‑300ppm；（c）最小谱图频率：25%； （d）谱图最大峰数目：70‑80；2）将确定的标准谱图与菌株名称进行统一，并标注该菌株的建库方法，完成该菌株的建库；其他菌株建库方法依次类推，完成微生物肽质量指纹图谱库的构建。