[发明专利]一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，属于食品安全检测领域。该试纸条由样品垫、金标垫、包被膜和吸水膜依次粘贴组合到PVC底板上，所述金标垫上涂覆有树枝状聚合物‑金‑适配体复合物增敏探针，包被膜上具有检测线和质控线，检测线上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体，质控线上包被有链霉亲和素。该试纸条的制备方法包括树枝状聚合物‑金‑适配体复合物增敏探针的制备、金标垫的制备、包被膜的制备以及试纸条的组装等。该试纸条利用树枝状聚合物‑金‑适配体复合物增敏探针进行信号放大，极大提高检测灵敏度，且操作简单、检测速度快，无需专用仪器设备，成本低廉，适合于大批量样品中沙门氏菌的高灵敏快速检测。

主权项

1.一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条，包括PVC底板(1)，在所述PVC底板(1)上依次粘贴有样品膜(2)，增敏探针金标结合垫(3)，硝酸纤维素膜(4)和吸水膜(5)四种粘贴物；相邻所述粘贴物之间相互连接叠放；所述硝酸纤维素膜(4)上依次设置有检测线(6)和质控线(7)；其特征在于，所述增敏探针金标结合垫(3)上包被有树枝状聚合物‑金粒子‑核酸适配体复合物；所述树枝状聚合物为端巯基树枝状聚合物；所述核酸适配体为能特异性识别沙门氏菌的核酸适配体，其DNA序列的5’端被巯基标记，3’端被生物素标记；所述检测线(6)上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体；所述质控线(7)上包被有链霉亲和素；所述用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条的制备方法包括如下操作步骤：(1)制备树枝状聚合物‑金粒子复合物；称取0.2 mg的树枝状聚合物溶解到5 mL丙酮中，取新合成胶体金粒径为10 nm的胶体金溶液1mL分散到5 mL纯水中，在氮气保护和快速搅拌下，将分散到纯水中的胶体金溶液逐滴滴加到树枝状聚合物溶液中，磁力搅拌下室温反应12 h后，10000 rpm 4℃离心30 min，弃上清，用纯水洗涤沉淀物，离心洗涤并重复3次后将沉淀用重悬液重悬，得到10倍浓缩的树枝状聚合物‑金粒子复合物溶液；所述重悬液包括以下组分：20 mM Na3PO4、5％BSA、0.25％Tween‑20和10％蔗糖；(2)制备树枝状聚合物‑金粒子‑核酸适配体复合物；取10μL 1μM的沙门氏菌核酸适配体加入到2μL醋酸缓冲液和3μL 1mM三羧甲基磷酸溶液中，室温避光放置1h，得到活化的沙门氏菌核酸适配体溶液；再将步骤（1）制备的200μL 10倍浓缩的树枝状聚合物‑金粒子复合物溶液逐滴加入到上述活化的沙门氏菌核酸适配体溶液中，室温下搅拌60 min；取170μL 100μM的dATP加入到上述反应液中，室温下继续搅拌30min；逐步将0.1M的NaCl溶液加入到反应液中，使NaCl的终浓度达到30 mM，室温下反应1h后放置于4℃冰箱过夜孵育；6500 rpm离心15 min后沉淀用重悬液重悬至200μL，得到树枝状聚合物‑金粒子‑核酸适配体复合物；所述醋酸缓冲液的浓度为0.5M，pH值为5.0；所述沙门氏菌核酸适配体DNA序列为：5’‑SH‑TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G‑biotin‑3’；(3)将步骤(2)制备的树枝状聚合物‑金粒子‑核酸适配体复合物喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7μL/cm，制备增敏探针金标结合垫，烘干备用；(4)在硝酸纤维素膜上的检测线位置喷涂抗沙门氏菌单克隆抗体溶液，在质控线位置喷涂链霉亲和素，烘干备用；(5)将样品膜、增敏探针金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水膜依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2 mm，切成3 mm宽的试纸条，与干燥剂一起封装于铝箔袋中保存备用。