[发明专利]一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法

摘要

本发明涉及用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，有效解决海藻糖合酶酶活力的分析工作繁重、操作成本高、样品处理繁琐的问题，用麦芽糖溶液制作成标准曲线，挑取产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种，于发酵产酶培养基中培养，制成发酵液，发酵液加入溶菌酶，离心，上清液与麦芽糖溶液混合，沸水浴使酶失活，上清液分装3支试管，加入3,5‑二硝基水杨酸显色液，测出试验样品麦芽糖含量，制备空白组样品，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，本发明方法易操作，检测速度快，成本低，效果好，方法稳定可靠、准确。

主权项

1.一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制作标准曲线：将麦芽糖250.00mg，溶于蒸馏水中，制成麦芽糖含量为1mg/mL的麦芽糖溶液，吸取麦芽糖溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分别加入蒸馏水定容至100mL，配制不同浓度的梯度麦芽糖溶液，取6支试管编号为1、2、3、4、5、6，分别吸取梯度麦芽糖溶液2.5mL，各加入2.5mL的3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温，于540nm波长下比色，记录各管的OD值，以光密度OD值为纵坐标，2.5mL梯度麦芽糖溶液中麦芽糖含量，单位为mg/mL为横坐标，制作成标准曲线；所述的3,5‑二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水700mL中，加热，趁热加入3,5‑二硝基水杨酸6.3g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却后加蒸馏水定容至1000mL；B、制备待测海藻糖合酶酶液：发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L磷酸缓冲液振荡洗涤2‑3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；所述的发酵液的制备方法是，在无菌操作下，从产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种挑取2‑3环，接种于60mL发酵产酶培养基中，37℃、160r/min摇床振荡培养48h制成；所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麦芽糖10.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏1.0g、K2HPO4 1.0g、NaH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g和蒸馏水1000mL混匀，调节酸碱度至pH7.2制成；C、海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1‑0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；制备空白组样品，测出麦芽糖含量:取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1‑0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL 3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；所述的质量浓度5%麦芽糖溶液是由麦芽糖5.000g加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液定容至100mL制成；D、活力测定：海藻糖合酶酶活力定义：在60℃、pH7.0条件下，以质量浓度5%麦芽糖为底物，每克干菌体1h产生1mg海藻糖为1个酶活力单位（U）；空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，实现快速定量检测海藻糖合酶酶活力。