[发明专利]一种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法

摘要

本发明涉及的是一种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法，这种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法：选取抗原抗体共表达的方式，将PEDV抗原基因S1和anti‑PEDV ScFv基因共同表达在大肠杆菌周质腔内，利用流式细胞术进行三轮淘选；用大肠杆菌表达ScFv基因后纯化PEDV抗体，用ELISA方法检测PEDV ScFv抗体特异性，命名为PEDV‑ScFv；具体通过抗PEDV ScFv文库的构建、抗PEDV抗体的制备两个步骤进行。本发明提供的猪源PEDV抗体不会产生免疫反应、针对性强、更容易筛选到中和活性高的抗体、制备周期短、速度快。

主权项

1.一种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法，其特征在于：这种重组猪流行性腹泻病毒抗体的制备方法：选取抗原抗体共表达的方式，将PEDV抗原基因S1和anti‑PEDV ScFv基因共同表达在大肠杆菌周质腔内，利用流式细胞术进行三轮淘选；用大肠杆菌表达ScFv基因后纯化PEDV抗体，用ELISA方法检测PEDV ScFv抗体特异性，命名为PEDV‑ScFv；具体通过抗PEDV ScFv文库的构建、抗PEDV抗体的制备两个步骤进行；抗PEDV ScFv文库的构建的方法如下：一、动物免疫及血清抗体效价的检测：3‑6日龄仔猪先以PEDV弱毒疫苗免疫，之后以中等毒力毒株攻毒，前后共3次；每次免疫或攻毒前1天及最后一次免疫1周后采血，间接ELISA检测血清抗体效价；96孔酶标板包被重组PEDV的S1蛋白，一抗为待测血清，每板设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为二抗，TMB显色，用酶标仪读取各孔OD值；最后一次免疫1周后，选用抗体效价高的阳性血清，加入叠氮钠至终浓度为0.2%，4 ^oC放置待用；将抗体效价较高的三头仔猪处死，取脾脏，将其置于300目尼龙网上研碎，取细胞悬液；脾细胞悬液加ACK lysing buffer，室温放置5 min，2000 g离心10 min，收集白细胞沉淀；按10⁶个细胞/ml的量加入Trizol，裂解细胞，提取总RNA；以提取的三头猪脾脏的淋巴细胞混合后的总RNA为模板，Oligo(dT)‑18为引物，参照M‑MLV反转录酶说明书，进行cDNA第一条链合成，并用1 μl反转录产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检查其质量；根据GenBank上已发表的猪抗体重链VH、轻链VL可变区基因的两端恒定区序列，分别利用引物设计软件Primer 5.0分析设计引物，并在重链上下游分别加入Nhe I、Nde I酶切位点，轻链下游分别加入Bam HI、Not I酶切位点；以免疫后猪脾cDNA为模板，分别以VH上游引物、VH下游引物和VL上游引物、VL下游引物进行梯度PCR扩增；对VH和VL扩增产物进行胶回收，并与pMD18‑T载体连接，转化DH5α，并随机挑取1个单菌落进行测序，确定获得的基因序列为猪源抗体；二、ScFv细菌展示抗体库的构建：以免疫后猪脾cDNA为模板，以VH上游引物、VH下游引物扩增重链可变区基因，其中VH的5’端引入NheI酶切位点，3’引入NdeI酶切位点，PCR产物利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化；取VH PCR纯化产物与pMD18‑T载体连接，转化DH5α，并随机挑取1个单菌落进行测序；进行Nhe I、Nde I双酶切，37^oC水浴3h，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行转化构建VH抗体库；次日，收集所有菌落并提取质粒，进行Bam HI、Not I双酶切鉴定；然后用BamH I、Not I对VL PCR回收产物进行双酶切；酶切后进行胶回收，连接并转化DH5α，涂布平板，37^oC过夜培养，收集菌落并提取质粒，即为PEDV‑ScFv抗体库；取构建的PEDV‑ScFv抗体库进行酶切鉴定和PCR鉴定，分别用Nhe I、Nde I和Bam HI、Not I对抗体库进行双酶切；取PEDV‑ScFv抗体库质粒为模板，分别使用VH和VL的上下游引物对其进行PCR鉴定；抗PEDV抗体的制备方法如下：一、流式细胞术筛选大肠杆菌pBSD‑PEDV ScFv展示文库：取上述收集的文库所有菌落用LB液体培养基稀释至OD₆₀₀≈0.2，37 ^oC培养2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至终浓度为2.5 mmol/L，诱导4 h；在1.5 ml Eppendorf管中加入1.5 ml培养物，6000 rpm离心3 min，去掉上清；菌体沉淀用350μl Sucrose /Tris solution重悬，Sucrose 的浓度为0.75mmol/L，Tris的浓度为0.1mol/L；加入35 μl浓度为10 mg/ml新鲜配制的溶菌酶母液；逐滴加入700 μl 1 mmol/L EDTA溶液，同时涡旋混匀；冰上孵育15 min；加入50 μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10 min；4 ^oC，10000 rpm离心10 min；原生质球沉淀用1 ml PBS溶液重悬洗涤，6000 rpm离心3 min，去上清；原生质球沉淀用100 μl PBS重悬；在100 μl PBS重悬的已诱导菌液中加入10 μl 质量体积比为1% BSA贮存液、1.5 μg FITC标记后的S1，冰上避光孵育1 h；8000 rpm，离心3 min，1 ml PBS重悬洗涤一次，沉淀用100 μl PBS重悬；设置阴性对照，将空白菌DH5α处理成为原生质球，空白菌DH5α中不含pBSD‑IBDV ScFv重组质粒，用标记后的VP2抗原孵育；用流式细胞仪于488 nm波长激光下，检测样品及阴性对照的荧光强度，收集样品中荧光强度高于阴性对照的部分；将分选出来的细菌进行质粒制备，电击转化至大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第二轮筛选，将每个峰值范围内的细胞分选出来，制备质粒后转化大肠杆菌DH5α，构建次级筛选库，按上述的方法进行第三轮筛选后，挑取单菌落20个，扩培后逐个用流式细胞仪进行检测，选出荧光信号比阴性对照强的克隆，进行测序并分析；二、抗PEDV ScFv抗体在大肠杆菌中的表达纯化及活性：将质粒测序后与网上的猪源抗体进行序列比对，利用引物设计软件Primer Premier 5.0分析设计PCR引物P1、P2，选取两个进行PCR扩增、纯化、连接入pMD18‑T载体，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，PCR和酶切鉴定后送去测序；测序结果正确后，对质粒进行双酶切，连入pET‑27b载体，转化入Rosetta中；挑取含有表达载体pET‑27b‑ScFv的Rosetta单菌落，分别接种于含有100 μg/ml Amp⁺的LB液体培养基中，37 ^oC过夜培养；次日取上述过夜培养物以1%的比例分别接种于含100 μg/ml Amp⁺的LB液体培养基中，37 ^oC振荡培养2h，加IPTG 37 ^oC继续培养，诱导4h；取1ml培养物菌体；洗涤后加入预冷PBS重悬；加入5×SDS样品缓冲液，煮沸5 min；取20μl样品进行SDS‑PAGE；电泳后，经考马斯亮蓝R‑250染色，用甲醇‑冰乙酸脱色液脱色，观察结果；挑取转化重组质粒pET‑27b‑ScFv单个菌落接种于含有100 µg/ml Amp+的LB液体培养基中，培养过夜；取上述两种过夜培养物以1%的比例接种于1L含有100 µg/ml Amp⁺的新鲜LB液体培养基中，37 ^oC振荡培养至OD₆₀₀值达到0.3时，加IPTG至终浓度0.25 mmol/L，37 ^oC继续诱导培养4 h；取出培养物于4 ^oC以12000 r/min离心5 min，收集菌体；弃上清，每20 ml菌液沉淀加入1ml Binding buffer重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，在冰上高强度超声破碎约40 min，每次10s，每次间隔10s；菌体经超声波破碎后12000 rpm 4 ^oC离心30 min，分别收集包涵体；洗涤后分别用变性液溶解4 ^oC过夜；将溶解后蛋白加入到10倍体积的复性液中，4 ^oC复性24 h，pH调至7.4左右；在经pH 7.4的PBS 于4 ^oC透析3次，每次8 h；纯化后的蛋白进行SDS‑PAGE，并用紫外分光光度计检测其浓度；将抗原蛋白以浓度梯度包被96孔板，于4 ^oC包被过夜；PBST洗96孔板3次，每次2 min，用5%脱脂奶粉37 ^oC封闭2h，分别加封闭液稀释的浓度梯度为100 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL阴性对照不加抗体的S1蛋白，37 ^oC孵育2 h，PBST洗96孔板3次，再加入二抗HRP‑goat anti‑porcine IgG (H+L)，37 ^oC温育1 h，PBS洗96孔板4次后，加入TMB底物液，于37 ^oC避光显色5 min，每孔加入50 μL终止液，用酶标仪于波长450 nm下检测其OD值。