[发明专利]一种苯胺绿人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种苯胺绿人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以N,N‑二甲基苯胺、苯甲醛衍生物为原料，Amberlyst 15 树脂为催化剂，在一定条件下合成苯胺绿半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：采用活泼酯和重氮化法分别将获得的半抗原与牛γ球蛋白(BGG)偶联，制备苯胺绿的人工抗原即苯胺绿‑牛γ球蛋白形成相应全抗原。所制备的苯胺绿人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯胺绿抗体，可用于各种苯胺绿免疫分析法的研究，为苯胺绿的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种苯胺绿人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将N,N‑ 二甲基苯胺和4‑ 羧基苯甲醛以摩尔比为2:1的比例加入圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物Ⅰ；(b) 称取2g产物Ⅰ,加入苯30ml以及5gAmberlyst 15树脂催化剂的，放入圆底烧瓶中，在氮气保护、130℃下回流搅拌过夜；反应结束后，将溶剂减压转干，用乙醚提取得产物Ⅱ；(c) 将产物Ⅱ经硅胶柱层析纯化,提取得到苯胺绿半抗原4‑(双(4‑ 二甲胺基)苯基)甲基苯甲酸(4‑MGC)白色固体；(2) 制备苯胺绿人工抗原：(d) 称取0.425g 半抗原和N‑ 羟基琥珀酰亚胺0.225g，溶于10.0mlN,N‑ 二甲基甲酰胺中,再慢慢滴加溶解有0.255g N，N‑ 二环己基碳二亚胺的10.0ml N,N‑ 二甲基甲酰胺,边滴加边磁力搅拌,结束后20℃磁力搅拌过夜,得到A液；(e) 将牛γ球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；(f) 在常温磁力搅拌条件下,将A液逐滴加入到10ml的B液中,得到人工抗原混合液，4℃冰箱内磁力搅拌过夜；(g) 制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，4℃搅拌透析,每4小时换一次缓冲液,透析2天, 紫外扫描透析液无小分子吸收峰时,将产物离心取上清,在无菌条件下通0.2μm 的滤膜，即得到苯胺绿人工抗原：苯胺绿‑牛γ球蛋白。