[发明专利]一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法

摘要

本发明提出了一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，构建了pMDGFP重组载体,并导入到舒伯特气单胞菌强毒株WL‑2中。在荧光显微镜下观察,菌体呈现绿色荧光。稳定性试验表明,WL2GFP传至30代,质粒稳定率可达100％。绿色荧光蛋白基因的导入为研究鳢源舒伯特气单胞菌与宿主的相互关系提供了一种简单而直观的方法。

主权项

一种绿色荧光蛋白基因标记鳢源舒伯特气单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离出鳢源舒伯特气单胞菌：(2)制备启动子片段：启动子(SEQ ID NO:1)以质粒PRUAL为模板，引物：ppS：5'CGCCTAGGATACGCACACCGTGGAAAC3'，ppA：5'CCTTGCTCACCATTTTTTCTTCCTCCA3'，PCR扩增后产物进行电泳以及胶回收；(3)制备GFP片段：绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO:2)以质粒PEGFP‑N3为模板，引物序列为：GFPS：5'AGGAAGAAAAA ATGGTGAGCAAGGGCGA3'，GFPA：5'CGTTCGAA TTACTTGTACAGCTCGTCCA3’；PCR扩增后产物进行电泳以及胶回收；(4)启动子与GFP连接：将步骤(2)中回收的启动子与步骤(3)中回收的GFP混合作为模板，进行PCR，电泳后进行胶回收；(5)PCR产物的T/A连接、转化与鉴定：将步骤(4)中纯化的PCR产物与pMD18‑T Vector克隆载体进行连接，转化后进行扩增，并测序鉴定得到的pMDGFP；(6)制备鳢源舒伯特气单胞菌感受态；(7)载体pMDGFP的获取、连接与转化：提取测序鉴定正确菌株的质粒pMDGFP，使用电转法转入到制备的鳢源舒伯特气单胞菌感受态中；(8)荧光菌株观察。