[发明专利]一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法

摘要

本发明公开了一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，步骤一，设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物；步骤二，片段扩增：将相应的待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，然后对扩增产物进行纯化；步骤三，片段连接。本发明提供的DNA片段连接方法利用了T4噬菌体DNA拓扑异构酶I同时实现酶切与连接的功能，传统的方法需要先利用限制性内切酶使DNA片段产生相匹配的末端，纯化后利用T4连接酶连接片段，因此具有更快捷高效的特点，本发明的方法中待连接片段内部的序列不会对连接产生影响，消除了传统方法中酶切步骤的缺陷。

主权项

一种利用T4噬菌体DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一，设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物，每条待连接片段设计正向引物和反向引物，引物结构为，相邻连接处前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5`到3`端依次包含接头DNA序列、T4噬菌体DNA拓扑异构酶I识别位点的DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接头序列反向互补配对，不同连接所用的互补接头片段序列各不相同；步骤二，片段扩增：将相应的待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，然后对扩增产物进行纯化；步骤三，片段连接：将步骤二中得到的纯化后的各扩增产物进行混合，加入T4噬菌体DNA拓扑异构酶I，在37℃下反应15min，得到完成连接的DNA片段。