[发明专利]一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所述方法采用所述试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显色剂显色，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。本发明检测试剂盒及检测方法具有特异性好、敏感性高、重复性好等特点。

主权项

一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；其中，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述标准阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清；所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230筛选方法如下：对牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型及F型菌株全基因组序列比较分析，根据预测具有信号肽的得分值，从A型、B型及F型共有的200多个基因中筛选出32个候选基因，以这些基因翻译成蛋白的氨基酸序列调入NCBI数据库进行比较分析及抗原表位分析，根据其比对结果，综合分析其总得分值、覆盖率、同源性及抗原表位结果，筛选出0230基因；再对0230基因及其编码蛋白进行生物信息学和PCR分析；所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230采用如下方法获得：以牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型CQ2菌株的DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增后的目的基因片段，将所述目的基因片段与原核表达载体pET30a连接，构建重组表达质粒pET30a‑Pm0230，将重组表达质粒pET30a‑Pm0230转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物经过His标签纯化柱纯化和透析除盐处理，获得所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230；所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述样品稀释液为含0.5 wt.% BSA、0.05 wt.% 吐温20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS缓冲液，所述样品稀释液的pH为7.2；所述浓缩洗涤液为25×PBST 洗涤液；所述显色液为TMB，反应终止液为2 mol/L的硫酸溶液；所述用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体采用如下方法制得：向固相载体中加入浓度为10 μg/mL的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，于4 ℃包被过夜后，弃去所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，向固相载体中加入质量浓度为1 %的卵清蛋白溶液，于37 ℃下封闭1.5 h；所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板；所述HRP标记的IgG酶标二抗为HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗。