[发明专利]一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法

摘要

本发明公开了一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。本发明通过进行PI金色链霉菌孢子染色法，利用流式细胞术对金色链霉菌孢子的活性检测，实现了对金色链霉菌孢子的活性区分以及孢子的绝对计数。对分析出的活孢子群进行进一步的分选培养，为金色链霉菌的高通量筛选提供一种方式。对分选后的活孢子采用固液结合的高通量培养方案，有效提高了金色链霉菌孔板生长率。显色反应和多孔板检测方法作为一种方便快速的检测手段，可对大量样本同时检测。本发明基于流式细胞仪分选有活性的金色链霉菌，为高通量筛选金霉素高产菌株提供一种新型有效的方式。

主权项

1.一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，其特征在于，主要包括步骤如下：（1）获得金色链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；（2）利用PI染料对步骤（1）的待筛选的孢子进行染色；（3）使用流式细胞仪检测孢子活性：以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体：以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体；（4）利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中：取染色后的金色链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪分析，用FL3 通道（610±15）nm检测，将无荧光区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子；（5）待高通量孔板的固体培养基上培养2~3天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；（6）配置一定浓度梯度的金霉素标准品，吸取Tris‑HCl缓冲溶液、浓度为5×10^‑4 mol/L 的Sm(NO)₃溶液、各浓度标准品溶液，将20 μL Tris‑HCl缓冲溶液、60 μL Sm(NO)₃溶液、120 μL 各浓度标准品金霉素溶液或者稀释后的发酵液震荡混匀至显色完全，用酶标仪检测，得到金霉素与405 nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，取发酵液上清，在合适的浓度下加入到含有Tris‑HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405 nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产金霉素含量的相对高低；（7）选取上一步得到的金霉素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。