[发明专利]一种重组载体及无转基因基因编辑植株的筛选方法有效
| 申请号： | 201610597205.1 | 申请日： | 2016-07-26 |
| 公开（公告）号： | CN106222193B | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 舒庆尧;芦海平;邓丽;刘松梅 | 申请（专利权）人： | 浙江大学;浙江之豇种业有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 | 代理人： | 胡红娟 |
| 地址： | 310027 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种重组载体及无转基因基因编辑植株的筛选方法，该重组载体中原始载体为含有sgRNA基因、Cas9基因和筛选标签基因的用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9载体，所述重组载体携带有BelRNAi表达元件，所述BelRNAi表达元件转录产生干扰苯达松抗性基因的发夹状RNA干扰片段。本发明在原始载体中引入BelRNAi表达元件，并对后代植株进行苯达松除草剂筛选，既保留了目的基因突变的后代，又确保了该突变后代中不含有转基因片段；筛选方法更为廉价，简单和有效。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 重组 载体 转基因 基因 编辑 植株 筛选 方法 | ||
【主权项】：
1.一种无转基因基因编辑植株的筛选方法，其特征在于，包括：(1)将重组载体转入水稻植株中，培养获得转基因水稻植株；所述重组载体的原始载体为pHun4c12，含有sgRNA基因、Cas9基因和潮霉素抗性基因；BelRNAi表达元件中启动子为d35S，终止子为NOS Terminal；还携带有BelRNAi表达元件，所述BelRNAi表达元件转录产生干扰苯达松抗性基因的发夹状RNA干扰片段；(2)从转基因水稻植株中筛选得到含重组载体同时目标基因已完成编辑的T0代植株；所述筛选的过程包括：(a)选取存在所述筛选标签基因的植株，得到含重组载体的转基因植株；(b)提取步骤(a)中含重组载体的转基因植株DNA，经测序，确定转基因植株中sgRNA锚定的靶片段区域的序列，从中挑取已发生基因突变的序列所对应的植株，获得含重组载体的转基因突变植株T0代；(3)继续培养T0代植株直至获得T1代种子；(4)种植T1代种子，在T1代幼苗期间，喷施除草剂苯达松；若水稻幼苗死亡，则为含有外源重组载体插入的水稻植株；反之，若幼苗正常生长，则为无外源重组载体插入的水稻植株，判定为无转基因基因编辑材料。
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