[发明专利]新疆野扁桃酵母双杂交质粒的构建方法

摘要

本发明涉及一种新疆野扁桃酵母双杂交质粒的构建方法，该方法将花粉自交不亲和决定因子编码基因SFB插入酵母双杂交质粒pGBKT7，将花柱自交不亲和决定因子编码基因S‑RNase插入酵母双杂交质粒pGADT7。目前尚无针对新疆野扁桃自交不亲和性决定因子间相互作用的研究，我们首次构建了新疆野扁桃酵母双杂交质粒，所构建质粒适用于新疆野扁桃的酵母双杂交分子互作实验。

主权项

一种新疆野扁桃酵母双杂交质粒的构建方法，其特征在于按下列步骤进行：a、提取新疆野扁桃花药总RNA：将总RNA反转录生成cDNA，以cDNA为模板，根据PtSFB17基因设计引物为：PtSFB17(ORF 1‑1131bp)上游引物：5'‑ CATGCCATGGagATGAGATTTACACTACATA‑3' PtSFB17(ORF 1‑1131bp)下游引物：5'‑ AAAACTGCAGTTAATAATTATTGAGTAAAAC‑3' PtSFB17(ORF 151‑1131bp)上游引物：5'‑CATGCCATGGagGTCACAAAGCATGACCATG‑3' PtSFB17(ORF 151‑1131bp)下游引物：5'‑ AAAACTGCAGTTAATAATTATTGAGTAAAAC ‑3'进行PCR扩增，提取新疆野扁桃花柱总RNA，将总RNA反转录生成cDNA，以cDNA为模板，根据PtS16‑RNase基因和Pt S17‑RNase基因设计引物为：Pt S16‑RNase(ORF 85‑690bp)上游引物：5'‑CGGGATCCatTTTTATGACTATTTTCAATTTG‑3' Pt S16‑RNase(ORF 85‑690bp)下游引物：5'‑CCGCTCGAGTTATGGAAACAAGATGTCAAC‑3' PtS17‑RNase(ORF 79‑678bp)上游引物：5'‑CGGGATCCatTCTTATGTGTATTTTCAATTTG‑3' PtS17‑RNase(ORF 79‑678bp)下游引物：5'‑CCGCTCGAGTTATTGAAAGGAGATGGCTC‑3'进行PCR扩增；b、将步骤a得的扩增产物进行双酶切，将所得到的DNA片段插入经过双酶切的的pGBKT7质粒或经过双酶切的pGADT7质粒得到重组质粒；c、将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆；d、将阳性克隆扩大培养，提取质粒送测；e、将测序正确的质粒转化酵母感受态细胞Y2HGold或Y187；f、pGBKT7重组质粒经SD/‑Trp筛选，验证质粒是否转入酵母，是否有毒性作用；pGADT7重组质粒经SD/‑Leu筛选，验证质粒是否转入酵母，是否有毒性作用；g、pGBKT7重组质粒经SD/‑Leu/X‑α‑Gal和SD/‑Leu/X‑α‑Gal/AbA筛选，验证质粒是否有自激活作用；pGADT7重组质粒SD/‑Trp/X‑α‑Gal和SD/‑Trp/ X‑α‑ Gal /AbA筛选，验证质粒是否有自激活作用。