[发明专利]一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法

摘要

本发明公开了一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法，与现有技术相比，本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。用于进行基因与骨骼发育的相关研究，也可进项其他方面探索研究，检测wnt16基因的缺失与其他器官的发育是否具有相关性，例如心脏具有很好的医学研究价值，同时敲除wnt16基因的斑马鱼其成长周期明显缩短，也具有很好的商业价值。

主权项

一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在GenBankTM、Ensembl或UCSC数据库上查询斑马鱼wnt16基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对wnt16基因的靶位点，靶点的选择必须遵循5’‑20bp‑NGG‑3’标准：其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG，靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响wnt16基因的整个结构域，从而改变基因的表达，两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT步骤二：构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成：首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1‑2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；特异性gRNA体外合成：用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切4h以上，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA，>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于3号外显子两端的内含子上：F(5’‑AGAAATCTCTCAGCCAAACACG‑3’)R(5’‑ATACTGCGAACAATTCCTTGCT‑3’)正向引物F：T7启动子+20bp靶序列+gRNA上游序列反向引物R：gRNA下游序列PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃10min，待PCR扩增完成后，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物，测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase‑Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mL RNase‑Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴1.5h；水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应20min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率，特异性gRNA的纯化：用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度，步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射：尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0‑1个细胞水平的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析，显微注射体系如下：步骤四：T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性：对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其wnt16基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；步骤五：注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤，步骤六：目的序列的TA克隆T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤七：质粒的Sanger测序：将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型，步骤八：获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代：通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率，受精三天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，然后进行PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代，如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2‑3个月，再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)，步骤九：获得斑马鱼突变体的F2代纯合子从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精三天后取部分胚胎进行鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增纯化后通过Bgl Ⅰ限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到wnt16突变体纯合子，如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。