[发明专利]一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法

摘要

本发明公开一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法。该方法利用聚乙酰亚胺敏化的TiO2八面体锐钛矿介观晶体作为光活性基底材料，通过硼掺杂碳量子点标记肽(B‑CODs@petide)对基底材料的信号放大作用，制备一种光电化学传感器并应用于胰蛋白酶的检测。基于PEI的稳定性及优良导电性，其与OAM复合能加快光生电子的转移速度并提高光电流信号，而具有竞争性捕光能力的B‑CODs及空间阻碍的肽链的引入将明显的降低光电流信号，当修饰电极在胰蛋白酶溶液中孵化，胰蛋白酶可以催化水解肽键，使B‑CODs@petide从电极表面释放，从而提高光电流信号，光电流信号与胰蛋白酶浓度在1×10‑7 mg/mL–1.0 mg/mL范围内呈线性。该方法可以用来监测不同的疾病早期诊断中各种蛋白酶及抑制剂筛选。

主权项

1.一种基于TiO2介观晶体的胰蛋白酶光电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤； 2）PEI/OAM/B‑CODs@petide修饰电极的制备：滴加4μL浓度为3mg/ml OAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入0.5 mg/ml PEI溶液中40 min，室温条件下晾干；继续滴加5μL浓度为5.0 wt. %的戊二醛溶液于电极表面，4°C 冰箱中放置1小时，接着用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗去多余的戊二醛，修饰电极在B‑CODs@petide溶液中4°C冰箱中孵化1 h，通过经典的戊二醛交联法将硼掺杂碳量子点标记肽修饰到电极表面；将修饰电极浸入20μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得PEI/OAM/B‑CODs@petide修饰电极； 3）胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以PEI/OAM/B‑CODs@petide修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10‑7 mg/mL–1.0 mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。