[发明专利]一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法

摘要

本发明涉及一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。该方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(338.6±134.2)×10⁸个(n＝25)，细胞扩增达179.6±24.2倍；其中，CD3⁺细胞约占98.61％±3.22％，CD3⁺CD8⁺细胞约占74.56％±5.19％，CD3⁺CD4⁺细胞约占27.42％±6.35％，CD3⁺CD56⁺细胞约占51.88％±7.49％，而CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞仅占3.27％±1.75％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达66.54％±5.18％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

主权项

1.一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为11.0～16.5U/mL；(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸腹水移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，离心；(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM‑V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；(4)TIL细胞的定向诱导活化：用AIM‑V完全培养基‑Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶～3.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，培养期间用所述AIM‑V完全培养基‑Ⅰ半量换液至少1次，所述AIM‑V完全培养基‑Ⅰ含有500～1000U/mL IFN‑γ、10～100U/mL IL‑2和3％灭活血清；(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM‑V完全培养基‑Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM‑V完全培养基‑Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL，所述AIM‑V完全培养基‑Ⅱ含有500～2000U/mL IL‑2、100～300U/mL IFN‑γ、20～50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清；(6)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。