[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法

摘要

本发明涉及微生物病毒领域，旨在提供一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法。该方法包括步骤：用病毒维持液将待纯化的病毒样品进行梯度稀释；接种Vero E6细胞并培养，待长至单层且细胞密度达90％以上备用；用病毒维持液清洗Vero E6细胞表层2‑3次，加入梯度稀释的待纯化病毒液和病毒维持液后吸附2h；用无菌PBS清洗细胞表层后，覆盖半固体培养基培养4‑5天，直至病毒空斑出现；挑取病毒空斑，获得病毒液。本发明明显缩短了PEDV纯化的时间，经过2‑3轮该操作，即可获得纯化的毒株。纯化后的毒株病毒滴度高，24h内可出现明显的细胞病变，便于病毒的大量培养与获取。该PEDV空斑纯化方法具有良好的应用前景，为疫苗的研制和相关科研的开展提供了技术支持。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)在6孔细胞培养板中接种Vero E6细胞，接种密度为3×105个/孔；然后加入细胞生长培养基，2mL/孔；将细胞培养板放置在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养18‑24h，待Vero E6细胞长至单层且细胞密度达90％以上，备用；(2)用病毒维持液将待纯化的病毒样品进行梯度稀释，制备10‑3、10‑4、10‑5、10‑6、10‑7稀释度的病毒液；(3)吸弃细胞培养板中的细胞生长培养基，用病毒维持液清洗Vero E6细胞表层2‑3次；(4)向各孔的单层Vero E6细胞中分别加入梯度稀释的待纯化病毒液，200μL/孔；再各加入200μL的病毒维持液，吸附2h；(5)病毒吸附结束后，吸弃6孔板中的病毒液，用无菌PBS清洗细胞表层2‑3次；向细胞表面覆盖半固体培养基，2.5mL/孔，4℃冰箱放置5min待琼脂凝固后，倒置放在细胞培养箱中培养4‑5天，直至病毒空斑出现；(6)挑取病毒空斑，获得病毒液。