[发明专利]一种加速5-氨基戊酸生物法生产的方法

摘要

本发明公开了一种加速5‑氨基戊酸生物法生产的方法，是通过在共表达L‑赖氨酸2‑单加氧酶基因davB和δ‑氨基戊酰胺水解酶基因davA的工程菌中过表达赖氨酸专一性透性酶基因lysP和4‑氨基丁酸转运蛋白基因pp2911，提高工程菌催化L‑赖氨酸生产5‑氨基戊酸的生产速率和得率。相比只表达L‑赖氨酸2‑单加氧酶基因davB和δ‑氨基戊酰胺水解酶基因davA的重组菌，本发明提供的过表达赖氨酸专一性透性酶基因lysP和4‑氨基丁酸转运蛋白基因pp2911的方法使得基因工程菌生产5‑氨基戊酸的产量提高了67.3％，转化率达到0.94mol/mol。本发明方法对于5‑氨基戊酸的工业生产极具应用前景。

主权项

1.一种加速5‑氨基戊酸生物法生产的方法，步骤是：(1)构建共表达赖氨酸专一性透性酶基因lysP和4‑氨基丁酸转运蛋白基因pp2911的基因工程大肠杆菌，以其作为全细胞催化剂用于转化生产5‑氨基戊酸；(2)全细胞催化剂的培养和收集；(3)利用生物催化剂转化制备含5‑氨基戊酸的转化液；其特征在于：步骤(1)所述的基因工程大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet‑DavAB‑LysP/pACYCDuet‑PP2911，该菌株含有的4‑氨基丁酸转运蛋白基因pp2911的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有的赖氨酸专一性透性酶基因lysP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有L‑赖氨酸‑2‑单加氧酶的基因davB和δ‑氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其构建方法如下:(a)从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440基因组中通过PCR方法扩增获得含有L‑赖氨酸‑2‑单加氧酶基因davB和δ‑氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB，并将davAB连接到质粒pETDuet‑1的多克隆位点1(MCS1)上，构建重组质粒pETDuet‑DavAB；(b)从大肠杆菌K12(MG1655)基因组中通过PCR方法扩增获得赖氨酸专一性透性酶基因lysP，并将lysP连接到步骤(a)构建的质粒pETDuet‑DavAB的多克隆位点2(MCS2)上，获得重组质粒pETDuet‑DavAB‑LysP；(c)从恶臭假单胞菌KT2440基因组中通过PCR方法扩增获得4‑氨基丁酸转运蛋白基因pp2911，并将pp2911连接到质粒pACYCDuet‑1的多克隆位点1(MCS1)上，获得重组质粒pACYCDuet‑PP2911；(d)将步骤(b)构建的质粒pETDuet‑DavAB‑LysP和步骤(c)构建的质粒pACYCDuet‑PP2911转化导入到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选获得基因工程大肠杆菌BL21/pETDuet‑DavAB‑LysP/pACYCDuet‑PP2911；步骤(2)所述全细胞催化剂的培养和收集方法是：在无菌条件下，将基因工程大肠杆菌BL21/pETDuet‑DavAB‑LysP/pACYCDuet‑PP2911菌液接种到含有100μg/mL氨苄青霉素和40μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37±1℃培养2～4小时使其OD_600nm＝0.6～0.8，然后加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导10～12小时；将培养得到的培养物以6,000±500转/分钟离心8～10分钟，收集菌体并用pH7.4、1/15 M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将菌体置于4℃的冰箱中冷冻保存，即获得全细胞催化剂；步骤(3)所述利用生物催化剂转化制备含5‑氨基戊酸的转化液的方法是：以细胞浓度为OD_600nm＝15～75的全细胞催化剂，在20～50℃、pH7.0条件下转化浓度为10～60g/L的L‑赖氨酸，经120±10转/分钟振荡反应24～48小时后，得到含5‑氨基戊酸的转化液。