[发明专利]后肾间充质细胞的制备方法

摘要

本发明提供一种后肾间充质细胞的制备方法，通过将Foxd1^cre转基因小鼠与DTR^flox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取高纯度的Foxd1⁺后肾间充质细胞。与目前已报道的分离特定细胞表型后肾间充质细胞的方法相比，本方法操作简单，所提取的Foxd1⁺后肾间充质细胞成分单一，纯度高；Foxd1⁺后肾间充质细胞提取量可控，可实现Foxd1⁺后肾间充质细胞的大规模生产制备。

主权项

1.后肾间充质细胞的制备方法，其特征在于，将Foxd1^cre转基因小鼠与DTR^flox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取标志物Foxd1阳性的后肾间充质细胞；具体为，将Foxd1^cre转基因小鼠与DTR^flox转基因小鼠进行交配，获取雌鼠受孕开始后第13.5‑15.5天内的胚胎，分离胚肾，将胚肾剪碎后接种于干细胞专用培养基中进行培养，同时对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选出基因型为Foxd1‑cre；DTR‑flox的双转基因型胚肾，培养60‑72小时后向培养基中加入终浓度100‑150ng/ml的白喉毒素，每48小时用含100‑150ng/ml白喉毒素的干细胞专用培养基换液1次，直至培养5‑7天，收集到的存活细胞即为标志物Foxd1阳性的后肾间充质细胞；对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选基因型为Foxd1‑cre；DTR‑flox的双转基因型胚肾的具体步骤如下：S1、Foxd1‑cre转基因小鼠的鉴定S11、胚鼠鼠尾基因组DNA提取；S12、采用PCR法进行检测：PCR反应体系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O补足至总体积20μl；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，重复35个循环；72℃10min，4℃维持；S13、结果检测：配制1.5％琼脂糖凝胶，每孔加入PCR反应产物5μl，在140V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电脉结果，如果出现450bp大小的扩增条带，则鉴定为Foxd1‑cre转基因小鼠；其中，S12中所用引物序列如下：上游引物F1 5’‑TCTGGTCCAAGAATCCGAAG‑3’，下游引物R15’‑GGGAGGATTGGGAAGACAAT‑3’；S2、Foxd1‑cre；DTR‑flox双转基因型小鼠的鉴定S21、以上述鉴定为Foxd1‑cre转基因小鼠的胚胎为材料，提取胚鼠鼠尾基因组DNA；S22、采用PCR法进行检测：PCR反应体系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH₂O补足至总体积20μl；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃30s，重复35个循环；72℃10min，4℃维持；S23、配制1.5％琼脂糖凝胶，每孔加入PCR反应产物5μl，在140V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电脉结果，如果出现650bp大小的扩增条带，则鉴定为Foxd1‑cre；DTR‑flox双转基因型小鼠；其中，S22中所用引物序列如下：上游引物F2 5’‑ACCATGAAGCTGCTGCCGTC‑3’，下游引物R2 5’‑TCAGTGGGAATTAGTCATGC‑3’；S3、从上述鉴定为Foxd1‑cre；DTR‑flox双转基因型小鼠的胚胎中分离胚肾，即为基因型为Foxd1‑cre；DTR‑flox的双转基因型胚肾。