[发明专利]一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用，本发明通过在植物中表达重组抗体Bevacizumab的重链和轻链融合蛋白，由于在融合蛋白中加入2A序列，使得抗体的重链和轻链得到接近1:1比例的表达，这个比例对完整抗体的组装起到明显的促进作用，我们的结果表明应用此系统表达的抗体产量较高。同时由于重组抗体的重链和轻链等比例的组装成比较稳定的四聚体结构，而减少了比较易降解的未组装多肽，因而得到较纯净一致的单克隆抗体。本发明将新法研制的贝伐单克隆抗体用于医药，用于治疗乳腺癌，用于治疗肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌和直肠癌。

主权项

一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1.设计含有2A序列及Furin切点的贝伐单抗重链和轻链融合蛋白，序列依次包含:1)抗体重链序列BHCMEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)2)重链内质网保留序列(KDEL)(SEQ ID NO:2)3)Furin蛋白酶切割位点(RRKR)(SEQ ID NO:3)4)连接肽(GSG)5)2A序列(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:4)6)抗体轻链序列BLCMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)7)轻链内质网保留序列(KDEL)步骤2.以水稻密码子优化并合成上述融合蛋白基因；步骤3.构建贝伐单抗植物双元表达载体；步骤4.采用农杆菌介导法将抗体基因导入水稻愈伤组织细胞并通过潮霉素筛选获得遗传转化水稻植株；步骤5.采用Southern Blot以及Western Blot方法检测贝伐单抗在水稻中的表达；步骤6.通过酶联免疫(ELISA)检测水稻中抗体的活性和含量；步骤7.通过ProteinA亲和柱分离纯化抗体；步骤8.通过SPR检测抗体对抗原的结合力；步骤9.通过蛋白酶水解及质谱分析仪分析贝伐单克隆抗体糖基化；得到合乎标准的贝伐单克隆抗体。