[发明专利]高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法

摘要

本发明是一种高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法，包括有恒温机构（1）、反应板（2）、荧光激发装置（3）、图像摄取机构（4）、便携式计算机（5），其中反应板（2）设置在恒温机构（1）的顶部，荧光激发装置（3）设置在反应板（2）的上方，图像摄取机构（4）设置在荧光激发装置（3）的上方，便携式计算机（5）与图像摄取机构（4）连接。本发明使用廉价的与便携式计算机连接的图像采集设备，通过实时拍摄环介导等温核酸扩增过程中的荧光强度，并通过分析检测食源性致病菌。本发明的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置体积小，用电池供电，在无市电条件下可进行野外作业完成样本的高通量核酸鉴定。本发明的检测方法操作简单，方便实用。

主权项

1.一种使用高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置的检测方法，高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置包括有恒温机构(1)、反应板(2)、荧光激发装置(3)、图像摄取机构(4)、便携式计算机(5)，其中反应板(2)设置在恒温机构(1)的顶部，荧光激发装置(3)设置在反应板(2)的上方，图像摄取机构(4)设置在荧光激发装置(3)的上方，便携式计算机(5)与图像摄取机构(4)连接，其特征在于检测方法是非诊断目的，其检测操作分为四个阶段：第一步是准备环介导等温扩增试剂和缓冲液、第二步是样品准备、第三步是加样、第四步是实时荧光成像和数据分析，各阶段具体如下：/n第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：/n对于每个样品，需总体积10-50μL的准备环介导等温扩增试剂和缓冲液溶液制备成分；/n准备环介导等温扩增试剂和缓冲液试剂包括如下组份，如下标示含量为终浓度：甜菜碱500-1500mM，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合物各1.5mM，1×等温缓冲液，硫酸镁5-15mM，引物混合物0.5-3.5μM，嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)热启动聚合酶0.4-1单位/μL，荧光染料20μM，上述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，曲拉通(Triton)X-100 8mM，氯化钾20mM组成；/n第二步：上述样品准备在无菌操作下取适量的食品、患者分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取1-2ml菌液离心，转速为5000rpm，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸10-12分钟，离心，转速为12000rpm，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA；阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理；/n第三步：上述加样按每孔10-30μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品，加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水；/n第四步：上述实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度，加上FITC滤镜拍摄荧光图像,图像依次保存后分析；/n进行DNA扩增的结果分析原理是荧光染料结合到LAMP产物双链DNA中，DNA拷贝数越多，荧光发射强度就越大；荧光图像用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)软件分析，使用原始像素集成密度分析方法\RawIntDen；该方法是把图像或选择区域中未经校准像素值取总和，板中的所有位置使用堆栈测量插件测量，形成Excel文件，然后将数值导入到matlab进行进一步的分析；/nMatlab程序读取ImageJ的所生成的Excel文件，并为每个孔创建一个数列，多个孔荧光强度值形成矩阵，这个矩阵中数值均进行归一化，即采用第一个孔的荧光值归一化，第一个孔被设置为1，程序把相对荧光单位(RFU)相对于时间绘制曲线，计算标准误差和阈值的平均值，阈值是由用户在1.2-1.4之间选择一个值，即手动定义为荧光强度的增量比噪声强度高20到40％，用于确定实验的非特异性扩增；/n使用荧光强度的导数随着时间变化进行阈值倍数分析，阈值时间定义为达到最大导数的时间，以这种方式，可以看到在阈值倍数的细小差别。/n