[发明专利]测定MPO卤化酶活性的方法

摘要

一种测定MPO卤化酶活性的方法，本发明的目的是用离子层析法从HL‑60细胞中分离出具有自然蛋白结构和酶活性MPO，建立测定MPO卤化酶活性方法，用纯化MPO作为校准品，测定人血清/浆中MPO卤化酶活性单位。本发明测定的MPO卤化酶从HL‑60细胞中分离。本发明建立NaI‑TMB（3,3’,5,5’‑tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺）法，直接测定血清/浆中MPO卤化酶活性，用于预测心脑血管疾病发生可能性及疾病预后。

主权项

1.一种测定MPO卤化酶活性的方法，其特征在于：测定的MPO卤化酶从HL‑60细胞中分离的步骤是：a、从HL‑60细胞中分离出MPO：培养HL‑60细胞, 离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液溶解细胞，再进一步用Dounce homogenization 破裂细胞，离心，收集细胞沉积物，细胞沉积物中含MPO；b、1% CTAB‑磷酸盐缓冲液溶解上述细胞沉积物中MPO；c、制备Q‑Sepharose 层析柱： 用0.5% CTAB‑磷酸盐缓冲液平衡Q‑Sepharose 层析柱，上述经1% CTAB‑磷酸盐缓冲液溶解的含MPO的细胞沉积物通过Q‑Sepharose 层析柱，结合蛋白到Q‑Sepharose 层析柱上，收集滤过液，滤过液含有pI=9.2的MPO；d、制备SP‑Sepharose 层析柱：用0.2% CTAB‑磷酸盐溶液平衡SP‑Sepharose 层析柱，上述含有pI=9.2的MPO滤过液通过SP‑Sepharose 层析柱，pI≥8.0蛋白结合到SP‑Sepharose 层析柱上，用600mM K2PO4‑磷酸盐缓冲液洗脱SP‑Sepharose 层析柱结合蛋白，收集含有MPO的洗脱液；e、放上述步骤d获得的洗脱液A至蛋白透析袋中，用150mM NaCl‑磷酸盐缓冲液透析；f、制备ConA‑Sepharose4B 层析柱：用100mM NaCl‑磷酸盐溶液洗涤ConA‑Sepharose4B,再与透析后蛋白液混合，ConA‑Sepharose4B结合糖化MPO，用500mM NaCl‑磷酸盐缓冲液洗涤ConA‑Sepharose4B 层析柱，用600mM a‑D‑methylmannoside ‑磷酸盐缓冲液洗脱ConA‑Sepharose4B 层析柱结合糖化蛋白，收集含有MPO的洗脱液；g、放上述步骤f获得的洗脱液B至蛋白透析袋中，用150mM NaCl‑磷酸盐缓冲液透析, 收集蛋白液，分装，放‑80°C 冻存；其中测定纯化MPO卤化酶活性单位：①加50ul工作液入微孔滴定板孔中；其中工作液是由NaPO4,pH6.5, NaCl, TauNH2组成；②加50ul纯化MPO至相应微孔滴定板孔中；③再加20ul H2O2溶液至每孔中，混均，反应5min；④加入 20ul过氧化氢酶至每孔中，混均，反应5min；⑤加入30ulNaI‑TMB底物液至每孔中, 混均；⑥放微孔滴定板到生化分析仪中，选用650nm 波长， 测定0min OD值；⑦持续反应5min后，用650nm 波长， 测定5min OD值；⑧计算∆OD值=OD5min–OD0min；其中测定血清/浆标本中MPO卤化酶活性单位：①加50ul工作液入微孔滴定板孔中；其中工作液是由NaPO4,pH6.5, NaCl, TauNH2组成；②加50ul血清及MPO校准品至相应微孔滴定板孔中；③再加20ul H2O2溶液至每孔中，混均，反应5min；④加入 20ul Catalase至每孔中，混均，反应5min；⑤加入30ulNaI‑TMB底物液至每孔中, 混均；⑥放微孔滴定板到生化分析仪中，选用650nm 波长， 测定0min OD值；⑦持续反应5min后，用650nm 波长， 测定5min OD值；⑧计算∆OD值=OD5min–OD0min。