[发明专利]一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法

摘要

本发明公开了一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，该方法包括以下步骤：采集、分离外周血单个核细胞；自然杀伤细胞分选；自然杀伤细胞的培养；自然杀伤细胞的收集。本发明利用免疫磁珠分选自然杀伤细胞，建立操作简单，综合效率更高，在体外扩增免疫磁珠法分选的NK细胞，是现有扩增方法效果的2‑3倍，在自然杀伤细胞的体外大规模扩增领域具有巨大的应用价值。

主权项

一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：一、采集、分离外周血单个核细胞；二、自然杀伤细胞分选；三、自然杀伤细胞的培养；四、自然杀伤细胞的收集；所述步骤三的自然杀伤细胞的培养包括以下步骤：1)用注射用生理盐水配制抗CD3单抗，抗CD28单抗，重组人纤维连接蛋白，加至1个T175培养瓶中，在4℃下放置12h；2)将1×10⁷～2×10⁷个细胞接种至T175培养瓶，加入T551培养基40mL，然后加入白细胞介素‑2、白细胞介素‑15、白细胞介素‑21、L‑谷氨酰胺和自体血清，置于二氧化碳浓度为5％培养箱中37℃条件下培养；3)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80％以上后，将细胞转移至3个T175培养瓶中培养，补充T551培养基至每瓶40mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素‑2、白细胞介素‑15、白细胞介素‑21、L‑谷氨酰胺和自体血清；4)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80％以上后，将培养瓶中的细胞转移至细胞培养袋培养，补充T551培养基至500mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素‑2、白细胞介素‑15、白细胞介素‑21、L‑谷氨酰胺和自体血清；5)2～4天后，补充T551培养基至1L，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素‑2、白细胞介素‑15、白细胞介素‑21、L‑谷氨酰胺和自体血清；6)2～4天后，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素‑2、白细胞介素‑15、白细胞介素‑21、L‑谷氨酰胺和自体血清；7)继续培养2～4天，即完成自然杀伤细胞的培养；所述步骤三的步骤1)中抗CD3单抗的浓度为5ug/mL；抗CD28单抗的浓度为0.5ug/mL；重组人纤维连接蛋白的浓度为50ug/mL；所述步骤三的步骤2)中加入白细胞介素‑2的终浓度为400IU/mL，白细胞介素‑15的终浓度为40ng/mL，白细胞介素‑21的终浓度为10ng/mL，L‑谷氨酰胺的终浓度为2mM，自体血清的最终体积百分比为5％；所述步骤四的自然杀伤细胞的收集包括以下步骤：1)对步骤三中培养获得的自然杀伤细胞进行无菌检测、内毒素检测和流式免疫表型检测；2)将步骤1)中检测后的自然杀伤细胞连同培养基400g离心10min，弃上清；3)用10mL无菌生理盐水重悬步骤2)离心得到的细胞，完全吹散细胞团块，混匀，细胞计数；4)用40～50mL无菌生理盐水洗涤细胞，400g离心10min，重复2～3次后，用无菌生理盐水重悬细胞，使细胞含量为2×10⁷个/mL；5)将步骤4)中的细胞悬液经细胞筛网过滤，转移至无菌输液袋或输液瓶中，并加人血白蛋白，混匀，即完成自然杀伤细胞的收集；加入人血白蛋白后人血白蛋白的最终体积百分比为5％。