[发明专利]基于HCR的液相芯片检测miRNAs方法有效

专利信息
申请号: 201610643310.4 申请日: 2016-08-08
公开(公告)号: CN106222276B 公开(公告)日: 2019-12-10
发明(设计)人: 李富荣;杨璐 申请(专利权)人: 深圳市人民医院
主分类号: C12Q1/682 分类号: C12Q1/682
代理公司: 11245 北京纪凯知识产权代理有限公司 代理人: 关畅;白艳
地址: 518020 广*** 国省代码: 广东;44
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摘要: 发明公开了基于HCR的液相芯片检测miRNAs方法,本发明提供了一种检测待测RNA中目标miRNA含量的方法,包括如下步骤A:1)根据1个或多个目标miRNA设计合成各自对应的探针M、探针1和探针2,2)将所述目标miRNA对应的探针M、所述目标miRNA对应微球、探针1和探针2进行HCR反应,得到HCR反应产物;3)荧光标记检测,根据是否含有荧光信号确定是否含有1个或多个目标miRNA。本发明的方法不仅使传统液相芯片的灵敏度得到了极大的提高,同时在定量范围、特异度和准确度方面都有良好表现,可以预见,为建立更加快速、灵敏、简单的miRNAs液相芯片检测体系将对肿瘤早期新标志物的提供了检测手段。
搜索关键词: 基于 hcr 芯片 检测 mirnas 方法
【主权项】:
1.一种检测待测RNA中目标miRNA含量的方法,所述方法不用于疾病诊断与治疗,所述方法包括如下步骤:/nA、建立标准曲线,方法包括如下步骤:/n1)根据每个目标miRNA设计合成各自对应的探针M、探针1和探针2,/n每个目标miRNA对应的探针M、探针1和探针2如下:/n所述探针M从5’端依次包括HCR引发链甲、与所述目标miRNA特异结合的片段乙和与所述目标miRNA对应微球的捕捉序列特异结合的片段丙;/n所述HCR引发链甲从5’端依次由单链DNA分子b*和单链DNA分子c组成;/n所述单链DNA分子c为不与所述目标miRNA序列相同或特异结合,且大小为6-8nt的单链DNA分子;/n所述与目标miRNA特异结合的片段乙从5’端依次由单链DNA分子b和单链DNA分子a组成;/n所述单链DNA分子b*和所述单链DNA分子b特异结合配对使所述探针M形成带有粘性末端的茎环结构;/n所述探针1从5’端依次包括所述HCR引发链甲的特异结合片段和所述目标miRNA;/n所述HCR引发链甲的特异结合片段从5’端依次由单链DNA分子c*和所述单链DNA分子b组成;/n所述目标miRNA从5’端依次由单链DNA分子a*和所述单链DNA分子b*组成;/n所述单链DNA分子b*和所述单链DNA分子b特异结合配对使所述探针1形成带有粘性末端的茎环结构;/n所述探针2从5’端依次包括HCR引发链甲、与所述目标miRNA特异结合的片段乙/n所述HCR引发链甲从5’端依次由单链DNA分子b*和单链DNA分子c组成;/n所述与目标miRNA特异结合的片段乙从5’端依次由单链DNA分子b和单链DNA分子a组成;/n所述单链DNA分子b*和所述单链DNA分子b特异结合配对使所述探针2形成带有粘性末端的茎环结构;/n所述特异结合为互补;所述单链DNA分子a*与所述单链DNA分子a互补配对,所述单链DNA分子c*与所述单链DNA分子c互补配对;/n2)将所述目标miRNA对应的探针M固定在微球上,再将固定探针M的微球分别和不同浓度的目标miRNA标准品溶液在所述目标miRNA对应的探针1和探针2的作用下,进行HCR反应,得到HCR反应产物;/n每个目标miRNA对应一种微球;/n每种微球的荧光颜色不同;/n3)荧光标记所述HCR反应产物,得到待检测产物;再检测所述待检测产物的荧光颜色和荧光强度,以所述目标miRNA标准品溶液的不同浓度的对数为横坐标,以所述目标miRNA标准品溶液的不同浓度对应的荧光强度的对数为纵坐标做标准曲线;/nB、将待测RNA替换不同浓度目标miRNA标准品溶液,重复步骤A,得到待测RNA中目标miRNA的荧光强度;/nC、将所述待测RNA中目标miRNA的荧光强度代入所述标准曲线中,得到待测RNA中目标miRNA含量;/n步骤2)包括如下a-c:/na、将所述目标miRNA对应的探针M溶液与微球溶液混匀得到反应体系1,反应,得到含有微球-探针复合物的体系;/nb、不同浓度目标miRNA标准品溶液分别和所述含有微球-探针复合物的体系混合得到反应体系2,反应,得到不同含有样本-微球-探针复合物的体系;/nc、将所述目标miRNA对应的探针1溶液、所述目标miRNA对应的探针2溶液与不同所述含有样本-微球-探针复合物的体系混匀得到反应体系3,HCR反应,得到不同HCR反应产物;/n所述探针1和所述探针2的5’和3’末端均标记生物素;/n所述荧光标记的标记物为链霉素-藻红蛋白;/n所述标记的反应条件为200 rpm转速下20℃温育30min;/n在步骤1)和步骤2)之间还包括如下步骤:将所述探针M、所述探针1和所述探针2均进行变性退火,得到处理后探针M、处理后探针1和处理后探针2。/n
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