[发明专利]一种高灵敏的无酶电化学免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种高灵敏的无酶电化学免疫传感器的制备方法及应用研究。利用简单的水热法合成由氮掺杂的石墨烯及核壳结构的银和二氧化铈组成的复合纳米催化剂，其对过氧化氢具有良好的电催化还原能力，将其标记信号抗体，作为模拟酶信号标签，实现分析信号的放大；通过简单的水热法在修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极表面生长三维放射状的氧化锌，其可以负载大量的捕获抗体，进一步提高检测的灵敏度。本发明构建的免疫传感器表现出线性范围宽、检测限低、重现性好、稳定性高等优良性能，在临床分析肿瘤标志物方面具有良好的应用前景。

主权项

1.一种高灵敏的无酶电化学免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）在氧化铟锡导电电极上沉积一层金纳米粒子：首先将氧化铟锡导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min，将清洗后的电极插入含有1%‑5% HAuCl4的沉积液中，利用电位溶出分析法，在沉积电位为‑0.2 V，沉积时间为30‑60 s，将金纳米粒子沉积在氧化铟锡导电电极的表面，沉积完成后，用二次水清洗电极表面，并在室温下自然干燥，获得修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极；（2）利用简单水热法在步骤（1）中获得的修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极表面生长三维放射状的氧化锌：将修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极插入含有10‑15 mL硝酸锌和六次甲基四胺混合液的25 mL高压釜中，使修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极倾斜地靠在高压釜内壁上，且导电面向下，所述的硝酸锌和六次甲基四胺的浓度均为5‑10 mM且摩尔比为1:1，在90‑100 ℃加热4‑6 h，待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面，并在60 ℃干燥3 h，获得修饰有氧化锌和金纳米粒子的氧化铟锡导电电极；（3）利用简单的水热法合成由氮掺杂的石墨烯及核壳结构的银和二氧化铈复合成的类酶纳米催化剂，首先合成氮掺杂的石墨烯：将15‑20 mL 28% 氨水加入到20‑25 mL 2 mg mL−1氧化石墨烯分散液中，然后加入300‑350 mg氢氧化钠，磁力搅拌30 min，将获得的混合液转移到80 mL的高压釜中，在180‑200 ℃加热10‑12 h，待冷却到室温后，将获得的混合液用0.01 M的盐酸离心洗涤至中性，再分别用乙醇和二次水各离心洗涤3次，最后将获得的样品在60 ℃真空干燥4 h；然后合成氮掺杂的石墨烯和银的复合物：称取5 mg 的氮掺杂的石墨烯于5 mL二次水中，超声溶解30 min，加入200‑300 μL 70‑80 mM硝酸银，在室温下搅拌1 h，随后加入100‑200 μL 30‑40 mM硼氢化钠，继续在室温下搅拌1 h后，用二次水离心洗涤3次，将获得的氮掺杂的石墨烯和银的复合物重新分散在5 mL二次水中；最后合成类酶纳米催化剂：将0.2‑0.4 mmol硝酸铈溶解在20 mL二次水和20 mL乙醇中，然后加入5 mL获得的氮掺杂的石墨烯和银的复合物，再逐滴加入10 mL 0.85%‑1%的精氨酸，将获得混合液在80‑100 ℃磁力搅拌加热3‑5 h，将获得产品用丙酮和二次水各离心洗涤3次，并在60 ℃干燥3 h；（4）将类酶纳米催化剂标记在信号抗体Ab2上，获得标记有Ab2的类酶纳米催化剂：称取2 mg类酶纳米催化剂分散在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，然后加入0.1 mL 2% 3‑氨丙基三乙氧基硅烷、0.1 mL 2.5% 戊二醛和200 μL 20 μg mL‑1 Ab2，在室温下震荡孵化2 h，随后用pH 7.4 PBS离心洗涤3次，获得标记有Ab2的类酶纳米催化剂，将获得的标记有Ab2的类酶纳米催化剂重新分散在1 mL pH 7.4 PBS中；（5）无酶电化学免疫传感器的构建：将20 μL 0.1 mM对氨基苯硫酚滴涂到步骤（2）中获得的修饰有氧化锌和金纳米粒子的氧化铟锡导电电极表面，并在室温下孵化4 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的对氨基苯硫酚，然后再将修饰有氧化锌和金纳米粒子的氧化铟锡导电电极插入含有2.5%戊二醛的溶液中2 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将10 μL 20 μg mL‑1捕获抗体Ab1滴涂到电极表面，并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的Ab1后，继续滴涂10 mL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点，利用pH 7.4 PBS洗涤后，滴加10 μL不同浓度的肿瘤标志物，在37 ℃下孵化30 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的肿瘤标志物，最后滴涂10 μL步骤（4）中获得的标记有Ab2的类酶纳米催化剂，并在37 ℃下孵化40 min，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的标记有Ab2的类酶纳米催化剂，完成无酶电化学免疫传感器的构建；（6）采用差分脉冲伏安法在由步骤（5）中获得的修饰有氧化锌和金纳米粒子的氧化铟锡导电工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行电化学信号检测，电压范围为‑1 ~ 0V，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms，所用的检测溶液为5 mL含有2 mM H2O2的pH 7.4 PBS溶液，通过电化学信号与肿瘤标志物浓度之间的关系，实现对肿瘤标志物的检测。