[发明专利]人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法

摘要

本发明涉及一种人精原干细胞体外分化为功能精子的三维诱导方法，属于生物工程领域。该方法在获得人精原干细胞的基础上，通过Matrigel构建了三维培养体系，添加诱导分化的关键因子，对精原干细胞进行体外诱导分化，获得了具有受精能力的精子细胞，并通过免疫细胞化学法鉴定诱导获得的精子细胞，通过荧光原位杂交技术（FISH）检测诱导获得的精子细胞染色体数目，通过圆形精子显微注射法（ROSI）检测诱导获得的精子细胞的受精与发育能力，本申请不仅为研究人类精子发生的分子机理提供优良的模型，并且，可以为无精症病人提供功能配子，将使男性不育患者拥有自己遗传背景的孩子。

主权项

1.人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：1)称取0.8～1.5g睾丸组织置于10mL DMEM/F12中，剪成体积约3×3×3mm³组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；2)用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mL DMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；3)向步骤2)的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10～15min；4)镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；5)静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；6)向步骤5)得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7)将步骤6)中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；8)消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10～15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9)加入30mL新鲜的DMEM/F12和10％FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；10)弃上清液，加入50mL DMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；11)弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40μm尼龙网过滤，除去细胞团；12)将步骤11)得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13)将0.1％明胶3mL加入到25cm²的培养瓶中，34℃培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12)得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞；14)将步骤13)中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术分离GPR125‑阳性精原干细胞；15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80％的人支持细胞上，34℃培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后，用0.25％胰酶消化3min，加入含10％FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的支持细胞；16)将步骤14)中分离的GPR125‑阳性精原干细胞与步骤15)收集的丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL 10⁶个混合细胞和0.4mL Matrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔板中；17)将步骤16)中接种好细胞的12孔培养板放入34℃培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34℃培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；所述诱导培养基配置如下：DMEM/F12、10％血清替代物(KSR)、2μM视黄酸(RA)、100ng/mL干细胞生长因子(SCF)、100ng/mL BMP4和10^‑6M睾酮；18)诱导20天后，采用流式细胞术分离得到单倍体精子细胞。