[发明专利]一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法

摘要

本发明公开了一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，该方法采用磁性分离和化学信息采集(液质联用)技术，分析靶标蛋白结合物，用于药物抗黑色素生成作用的筛选和评价。本发明通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH值、离子强度和变性清洗液。本发明与传统筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应，能够用于大规模天然产物库或组合化学库的筛选，适合于在早期开展对于抗黑色素生成药物(包括化学合成药以及天然产物)的筛选和先导化合物的发现，具有快速、准确、重现性好等优点。

主权项

1.一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液清洗2～3次，每次10～15min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4～6min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；(2)取步骤(1)得到的活化磁珠，加入酪氨酸酶溶液，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4～6min，移除键合剩下的上清液，得到酪氨酸酶键合磁珠；(3)取芍药苷，加入步骤(3)制备得到的酪氨酸酶键合磁珠，加入PBS缓冲液，放在振荡器上混匀，在34.84℃，离子强度为193.67mM，pH为6.98条件下孵育30min，然后放在磁铁上，使键合磁珠与溶液分开，先用PBS缓冲液清洗4次，再用10％乙腈的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析；液质分析的液质参数为ESI负离子模式；液相条件为:XBridge C18柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相A相为0.1％甲酸水–B相为乙腈，梯度洗脱：0min，10％B；10min，15％B；25min，30％B；60min，100％B，流速1.0mL·min‑1，柱温30℃，进样体积5μL；质谱条件：负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压‑4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压‑60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100‑1500，二级质谱激活类型CID。