[发明专利]一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法

摘要

本发明公开了一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，该方法包括以下步骤：细胞培养；质粒pXJ40‑myc‑TSP4的构建；Western印迹检测；免疫荧光；总RNA提取及实时荧光定量PCR；统计学处理。本发明旨在探究TSP4在NG2细胞向神经元细胞分化中的作用，并阐明TSP4调控NG2神经元分化的分子机制。TSP4可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性，促进NG2细胞向神经细胞转分化。本发明提供了一种实验手段，将TSP4在NG2细胞中过表达后，可有效诱发NG2细胞分化为神经细胞。本发明可为TSP4基因应用于脊髓损伤及神经退化性疾病的治疗提供重要依据。

主权项

一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12培养基，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，B27supplement，N2supplement置于5％CO2的37℃恒温培养箱；步骤2、表达质粒pXJ40‑myc‑TSP4的构建根据GenBank中TSP4基因的mRNA序列NM_017133.1，并利用DNAMAN8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增TSP4基因，将扩增出来的片段连接到pXJ40‑myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析，将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序；步骤3、Western印迹检测加入RIPA裂解液将细胞裂解，提取总蛋白，采用Bradford方法对蛋白质进行定量，加入5×SDS‑PAGE上样缓冲液，100℃煮5分钟后上样，80V电泳30分钟，再120V电泳50分钟，390mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜，用TBST漂洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗孵育1小时，TBST漂洗3次，每次5分钟，Amersham Imager600仪器进行化学发光，并用ImageJ1.48软件进行灰度分析；步骤4、免疫荧光将转染好的NG2细胞加入到铺有细胞玻片的12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理：4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；0.1％Triton X‑100室温透化10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；用3％BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟；加入MAP2、NF200一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟，然后加入FITC标记的二抗，孵育2小时，DAPI复染5分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，90％甘油封片，激光共聚焦显微镜进行观察拍照；步骤5、总RNA提取及实时荧光定量PCRTrizol试剂抽提细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，操作参照说明书进行，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，检测目的基因的表达，引物序列如下：GAPDH：5’‑GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG‑3’；5’‑GCT TCC CAT TCT CAG CCT TGA‑3’；NF200：5’‑ACC TAT ACC CGA ATG CCT TCT‑3’；5’‑AGA AGC ACT TGG TTT TAT TGC AC‑3’；NeuN：5’‑CAG GCC TCA GAA ACA CAC AA‑3’；5’‑AGC ACCAGTAGAAATGGATGA‑3’；Tuj1：5’‑TGA CGA GCA TGG CAT AGA CC‑3’；5’‑TGT TGC CAG CAC CAC TCT GA‑3’；NeuroD1：5’‑CTT GGC CAA GAA CTA TAT CTG G‑3’；5’‑GGA GTA GGG ATG CAC CGG GAA‑3’；反应体系为：EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA 2μL，双蒸水6.8μL，反应程序：95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环；基因的相对表达量用法计算，大鼠GAPDH作为内参基因；步骤6、统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理；以均数±标准差表示，各组见观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。