[发明专利]一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法

摘要

本发明公开了一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，该方法包括：取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取雄蕊，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；将小鳞茎从愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。本发明以雄蕊为外植体，通过消毒处理、诱导愈伤、小鳞茎再生和增殖以及小鳞茎膨大和生根培养，获得蓝晶花小鳞茎再生体系；显著降低了污染率，提高了诱导率和增殖效率，缩短了扩繁周期。

主权项

1.一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体取材及处理于蓝晶花花期6月，采长1.5～2.5cm花苞未打开的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4℃冰箱中冷藏1周；将所述冷藏后的花蕾材料转移至烧杯中，在滴加了少许吐温及洗洁精的水中浸泡20min，随后将纱布覆盖于烧杯口，隔纱布用流水冲洗1.5h；将冲洗后的外植体置于75％的乙醇中浸泡30s，再置于0.1％升汞中浸泡处理10min，浸泡过程中不断摇晃使外植体与消毒试剂充分接触；用无菌水漂洗5遍，每遍不少于3分钟，直至无明显泡沫出现；用镊子取出外植体，置于无菌操作台上，用滤纸吸干表面水分，待接种；(2)外植体接种及愈伤组织诱导于超净工作台上，用灭菌镊子和解剖刀将步骤(1)消毒处理后的幼嫩花蕾剥离开，切取雄蕊外植体基部伤口处轻插入培养基中，平铺接种于愈伤诱导培养基上；在培养温度为25±2℃的全黑暗诱导条件下60d开始出现愈伤组织；所述愈伤诱导培养基以MS培养基为基本培养基，即每升培养基添加4.43g MS粉，所述培养基中还含有30g/L的蔗糖，8g/L琼脂，0.5mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤，2.0mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸，pH值为5.8；(3)小鳞茎再生将雄蕊外植体连同愈伤组织团块一起于超净工作台上转接到新鲜的愈伤诱导培养基，进行90d的小鳞茎诱导培养；每30d继代一次，至小鳞茎直径达0.4‑0.5cm；培养环境的光照强度为12.5μmol·m‑2·s‑1，光照时间14h·d‑1，温度为25±2℃；(4)小鳞茎增殖将分化形成的小鳞茎从愈伤组织团块上分离下来，转入增殖培养基，每4周继代一次，以维持小鳞茎持续增殖；在光照强度为12.5μmol·m‑2·s‑1、光照时间14h·d‑1，温度为25±2℃的条件下进行90d的小鳞茎增殖培养；所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，即每升继代培养基中添加4.43g MS粉，增殖培养基中还含有30g/L的蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤、0.5mg/Lα‑萘乙酸，pH值为5.9；(5)小鳞茎膨大及生根培养：用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入培养基中，进行小鳞茎的膨大及生根诱导；在光照强度为12.5μmol·m‑2·s‑1、光照时间14h·d‑1，温度为25±2℃的培养条件下培养90d，可获得蓝晶花小鳞茎；所述膨大及生根培养基以MS培养基为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43g MS粉，膨大培养基中还含有浓度为2.0mg/L的α‑萘乙酸、90g/L的蔗糖、8g/L的琼脂；pH值为5.9。