[发明专利]构建稳定高效表达c-met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法

摘要

本发明公开一种稳定高效表达c‑met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞株的构建方法，通过构建c‑met基因慢病毒表达载体，并转染到BMSCs，以获得稳定、高效表达c‑met蛋白的BMSCs细胞株；本发明获得的BMSCs细胞株可以稳定分泌表达c‑met蛋白，蛋白表达量较高，且可稳定传代等，对于肝衰竭、肿瘤等疾病的研究具有重要意义。

主权项

1.一种构建稳定高效表达c‑met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株的方法，其特征在于，具体步骤如下：A）选取4周龄SPF级SD雄性大鼠，提取并培养BMSCs；B）分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，以c‑met基因为模板，进行PCR扩增目的基因c‑met并测序鉴定；PCR反应体系： 5×PS Buffer 10μl，2.5 mM each的dNTP Mix 4μl，10 µM的上游引物1μl，10 µM的下游引物1μl，10 ng/µL的模板1μl，PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 补足至50μl；PCR反应条件：98℃预热5min；98℃ 10s，55℃ 10s， 72℃ 90s，共30个循环； 4℃ 延伸；C)利用限制性内切酶AgeI酶切慢病毒载体GV358，于37℃反应3 h，即获得慢病毒载体GV358的酶切产物线性化载体DNA；酶切体系：10×CutSmart Buffer 5µl，1 µg/µL的纯化的质粒DNA2µl，10 U/µl的限制性内切酶AgeI酶1µl，ddH₂O补足至50µl；D)配制线性化载体DNA和目的基因重组反应体系，于37℃反应 30 min，获得慢病毒表达载体GV358‑c‑met；重组反应体系： 5×CE II Buffer 2µl，步骤C）获得浓度为800ng/µL的线性化载体 DNA 2.5µl，步骤B）获得浓度为700ng/µL的目的基因c‑met 1µl，Exnase II 1µl，ddH₂O补足至10µl；E)向离心管中加入GV358‑c‑met 20μg、 pHelper1.0 15μg、pHelper2.0 10μg，以Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂补足至1ml，室温下孵育15min；然后滴入细胞密度为70%～80%的293T细胞中，于37℃，5% CO₂ 培养6h，然后弃去培养基，加入含10%血清的细胞培养基，于37℃、含 5% CO₂ 继续培养 48‑72h；所述细胞密度为70%～80%的293T细胞是这样获得的：转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的细胞培养基调整细胞密度为5×10⁶ 细胞/15 ml，接种于直径为10cm的细胞培养皿中，于37℃、含5% CO₂ 的培养箱内培养，待细胞密度达70%～80%时即可用于转染；并于转染前2h更换培养基为无血清培养基；F）收集293T 细胞上清液，于4℃，4000 g 离心10 min；取上清液以0.45 μm 滤器过滤，再收集滤液于4℃，25000 rpm，离心2h；弃去上清，加入病毒保存液,即获得c‑met基因慢病毒；G)将对数生长期的BMSCs接种于96孔板中，每孔加入4～5×10⁴个细胞及100μl含10%血清的细胞培养基，当细胞融合度达到30%时，弃去培养基，向各孔中加入10μl步骤F）获得病毒滴度为2×10⁸ TU/ml的c‑met基因慢病毒、10μl终浓度为5μg/ml的ploybrene增强液和80μl的含10%血清的细胞培养基，于37℃、5% CO₂ 培养；感染12h后，弃去培养基，每孔加入100μl含10%血清的细胞培养基；感染72h后，再次以含10%血清的细胞培养基换液，并向每孔加入终浓度为9μg/ml的嘌呤毒素；待显微镜下观察细胞荧光阳性率达100%后，将药物筛选浓度维持在1.8μg/ml，即获得稳定高效表达c‑met蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞株；其中，所述含10%血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分比计，将89%的DMEM培养基、10%的胎牛血清及1%的青霉素‑链霉素溶液混合后获得。